摘要
贵州木霉 NJAU4742 （ Trichoderma guizhouense NJAU 4742 ）属于哈茨木霉（Harzianum clade），是一种有益丝状真菌。该菌株是由南京农业大学沈其荣教授团队从土壤样品中分离获得的一株具有显著促生和广谱生防作用的木霉菌株。贵州木霉菌 NJAU 4742 合成多种生防因子，包括分泌胞外水解酶和抗菌次生代谢产物来破坏植物病原真菌的细胞结构，从而抑制病原真菌生长、保护植物健康生长。同时NJAU 4742 还能分泌效应蛋白（effectors）促进植物生长以及激发植物免疫，从而提高植物的抗病性。 先前关于真菌效应蛋白的鉴定与功能研究主要集中在动植物病原丝状真菌中，已经发现这些病原真菌可向寄主转运不同种类的效应蛋白干扰寄主的细胞代谢过程，促进病原真菌的侵染。与此不同，本研究以生防贵州木霉菌 NJAU 4742 为对象，侧重从中鉴定具有抗真菌活性的效应蛋白，为开发相应的抗真菌生防产品，服务于植物真菌病害防控提供支撑，主要研究结果如下： 以贵州木霉菌 NJAU 4742 的参考基因组为切入点，利用生物信息学手段，对其全蛋白组进行分析，（i）通过 BLAST 方法选择与植物病原真菌中致病相关效应蛋白具有同源性的分泌蛋白（Evalue:1E-5）；（ii）结合贵州木霉菌与病原真菌互作时的转录组数据，选择效应蛋白基因在贵州木霉与病原真菌互作过程中的上调倍数大于 10倍或自身半胱氨酸(Cys)富集程度大于 5%为筛选标准,从贵州木霉菌中鉴定了 43个符合筛选标准的候选效应蛋白。 为了探究这些预测的效应蛋白是否对真菌细胞有毒性，本研究选择了两种真菌模型，第一是丝状（多细胞）植物病原真菌--禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)，它是分子植物病理学研究中一种已报道的模式丝状真菌模型；第二种是广泛应用的单细胞真菌研究模型--酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。本研究首先构建了针对禾谷镰刀菌基因诱导表达系统，在此基础上，构建了相应的基因表达载体，并成功将12 个来自贵州木霉菌效应蛋白转入禾谷镰刀菌中。对转化效应蛋白的禾谷镰刀菌转化子生长速率、分生孢子产孢量、以及转化子与贵州木霉菌平板对峙后菌落直径与菌落生长状态等表型进行测定，发现所有转贵州木霉菌效应蛋白的禾谷镰刀菌与未转化的禾谷镰刀菌野生型菌株在所测表型上均并无显著差异，因此本研究在 12 个贵州木霉菌效应蛋白中并未筛选到对丝状真菌具有毒性（抗真菌）的木霉菌效应蛋白。 与此同时，本研究利用成熟的酿酒酵母基因诱导表达系统，对来自贵州木霉菌的 33 个效应蛋白开展了毒性筛选。通过对酿酒酵母转化子菌落生长情况的检测，从中成功筛选出贵州木霉菌效应蛋白Tg10636在盐胁迫（0.6 M NaCl）下可以显著抑制酿酒酵母生长。同时发现贵州木霉菌效应蛋白Tg10636、Tg3425以及Tg8975在氧化压力胁迫（ 1 mM H2O2 ）下可显著抑制酿酒酵母生长，其中贵州木霉菌效应蛋白Tg10636属于金属 β-内酰胺酶家族蛋白，Tg3425属于假定蛋白，Tg8975属于磷脂酶样蛋白。值得一提的是上述 3 个对酿酒酵母具有毒性的贵州木霉菌效应蛋白（Tg10636、Tg3425 以及 Tg8975）对丝状（多细胞）真菌--禾谷镰刀菌没有细胞毒性，揭示这3个贵州木霉菌效应蛋白可能对单细胞真菌具有特异性的抗真菌活性。 综上所述，本研究成功在贵州木霉菌 NJAU 4742 中筛选出在氧化压力或盐胁迫条件下对单细胞真菌（酿酒酵母）具有毒性的效应蛋白，为后续利用这些毒性效应蛋白有针对性的开发靶向单细胞病原真菌（如白色念球菌）的抗真菌药物研发奠定了基础。
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