摘要
目的:基于重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)建立并优化金黄色葡萄球菌及其耐药基因的快速检测方法，以期为临床金黄色葡萄球菌感染相关疾病的早期诊断及精准治疗提供快速可靠的实验室依据。研究一，针对金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因nuc及代表四个抗生素家族的10种耐药基因建立一种实时荧光重组酶聚合酶扩增(Fluorescent signal monitoring RPA,RPA-FSM)检测方法;研究二，为了满足床旁、现场、基层甚至家庭的检测需求，针对上述基因序列，建立重组酶聚合酶扩增联合侧向流动免疫层析(Lateral flow strip detection,LFD)检测方法(RPA-LFD)。 方法:1.方法构建阶段:选取金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因(nuc)、青霉素耐药基因(blaZ)、甲氧西林耐药基因(mecA)、大环内酯类(包含林可酰胺)抗生素耐药基因(ermA、ermB、ermC、msrA)、四环素类抗生素耐药基因(tetK、tetM)、氨基糖苷类抗生素耐药基因(aadD、aacA-aphD)作为靶标基因，按照TwsitDXInc公司提供的RPA引物和探针设计原则，设计并筛选出效率最高的引物和探针;利用筛选出的引物、探针分别构建RPA反应体系，并从上游引物、探针、镁离子的添加量等3个方面对反应体系进行优化;最后以优化后体系筛选出最佳反应温度及时间。2.方法验证阶段:以常见葡萄球菌(非金黄色葡萄球菌)、球菌及数种临床常见病原菌作为阴性对照菌，验证所建立两种RPA方法(nuc)的特异度;构建各个基因的重组质粒并对质粒进行梯度稀释，之后将不同浓度的质粒作为模板，验证所建立两种RPA方法对各个基因的灵敏度;最后，使用54份金黄色葡萄球菌感染患者的临床样本，对所建立的两种RPA方法进行临床验证。 结果:研究一:通过RPA基础反应联合琼脂糖凝胶电泳对候选引物及exo探针筛选，而后针对反应体系、反应条件对RPA-FSM方法逐步进行优化，优化后的RPA-FSM方法可在39℃反应温度下，20分钟内完成对金黄色葡萄球菌的检测。使用nuc RPA-FSM方法检测15种非金黄色葡萄球菌病原菌基因组DNA,结果显示本法与其他病原体无交叉反应，表现出良好的特异性;以梯度稀释的各基因质粒标准溶液为DNA模板，验证RPA-FSM方法的灵敏度，结果显示本法对金黄色葡萄球菌nuc及其10种耐药基因的检测下限为1×101copies/μL;研究二:采用研究一中筛选出的引物及探针序列建立RPA-LFD方法，并相应地针对反应体系、反应条件对RPA-LFD方法逐步进行优化，优化后的RPA-LFD方法可在37℃反应温度下，15分钟内完成对靶序列的扩增并在5分钟内即可完成对结果的可视化判读。在特异性及灵敏度验证阶段，本法显示出与RPA-FSM方法一致的特异性及灵敏度。 临床样本验证阶段，以临床培养-药敏试验作为金标准，评价所建立的两种方法，在准确性评价上，本平台针对β内酰胺类、大环内酯类、四环素类及氨基糖苷类抗生素耐药的检出敏感度分别在95％以上、96％以上、88.89％及100％,特异性在71％以上、92％以上、97.22％及96％,阳性似然比可达3.35-32,阴性似然比仅为0.038-0.11;在可靠性评价上，本平台针对四类抗生素耐药的检出准确度均在87％以上;在实用性(即收益)评价上，本平台针对四类抗生素耐药的检出上具有较高的阳性预测值(除氨基糖苷类RPA法外均大于90％)和阴性预测值(除青霉素RPA法外均大于90％)。 结论:本研究基于重组酶聚合酶恒温扩增技术，开发了两种针对金黄色葡萄球菌及其耐药性的快速诊断方法，并对其进行了初步评价;这两种方法可在20分钟内完成对金黄色葡萄球菌的菌种鉴定及耐药分析，具有耗时短、灵敏度高、特异性好、操作简便等共同优点;在进一步比较中，两种方法则各有所长，可满足各种场合的检验需求，有助于门急诊、住院儿童等不同场合金黄色葡萄球菌感染的诊断与防控。
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