摘要
MicroRNA (miRNA) 是一类由18-24个碱基组成的非编码 RNA分子，其广泛存在于动植物体内，在细胞增殖、分化、凋亡等过程中发挥着重要作用。另外，miRNA 的异常表达也被证明与癌症等多种疾病相关。因此，miRNA 的检测对其本身的生物功能研究及疾病的临床诊断和治疗具有重要意义。本论文将基于连接反应的核酸扩增技术与CRISPR-Cas12a 基因编辑系统结合，建立了 miRNA 检测的新方法，具体研究内容如下： 一、连接-聚合酶链式反应 (PCR) 结合CRISPR-Cas12a系统检测miRNA。基于连接PCR 原理设计了一对 DNA 连接探针，其中包含引物的识别序列及原间隔子相邻基序 (Protospacer Adjacent Motif, PAM) 位点。在SplintR连接酶的催化作用下这对探针被连接成长链 DNA。然后，以连接产物为模板进行 PCR 扩增。扩增产物能够与 CRISPR-Cas12a系统中的向导RNA特异结合，激活Cas12a酶产生较强的非特异性核酸酶活性。荧光猝灭的单链 DNA报告探针产生荧光释放，实现了 miRNA检测信号的二次放大。本方法的线性范围跨越 3个数量级，定量限为 4 aM。该方法避免了繁琐耗时的反转录步骤，同时为miRNA的高灵敏、高特异检测提供了一种新思路。 二、连接酶链式反应 (LCR) 结合CRISPR-Cas12a系统检测miRNA。基于 LCR的原理设计了两对 DNA 探针，其中用于第一步连接的探针上设计了 PAM序列，连接产物可作为模板进行 LCR。LCR 扩增产物能够特异激活 CRISPR-Cas12a 系统，进而Cas12a酶对报告探针进行非特异性切割，实现了miRNA的高灵敏检测。另外，我们对报告探针中靠近荧光团附近的碱基进行了硫代修饰，使报告探针被切割后可直接进行实时荧光检测和基于阳离子共轭聚合物的可视化检测。该方法的线性范围跨越4个数量级，最低能够定量0.4 aM miR-221。该方法为LCR的均相检测提供了一种新策略，极大地拓展了LCR在均相、超灵敏及可视化检测miRNA方面的应用。
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