摘要
目的： 阿霉素（Doxorubicin，DOX）的临床应用因其心脏毒性而受到限制。许多研究表明微RNA（MicroRNA，miRNA）在DOX诱导的心脏毒性中至关重要。本研究旨在探讨let-7i-3p在DOX诱导的心脏毒性中的作用及其潜在机制。 方法： 使用适当浓度的DOX对人源性AC16心肌细胞进行处理，以处理前的AC16细胞作为对照组，通过RNA测序（RNA sequencing， RNA-seq）技术分析鉴定差异表达基因（Differentially expressed genes ，DEGs）；通过基因本体（Gene ontology，GO）、京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）对DEGs进行富集分析；使用STRING在线数据库结合Cytoscape软件分析蛋白互作关系（protein-protein interactions，PPI）并绘制出可视化网络图；通过定量实时聚合酶链反应（ quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）验证差异基因并筛选出差异最显著的基因用于后续研究。使用筛选出的miRNA模拟物（mimic）和抑制物（inhibitor）转染AC16细胞，设置转染后DOX处理组，通过检测细胞活力、细胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生情况、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，以及细胞凋亡和自噬，评估miRNA对DOX处理的AC16细胞的细胞活力、氧化应激以及细胞凋亡和自噬的影响。使用生物信息学预测软件结合RNA-seq结果筛选let-7i-3p 的靶基因，使用 qRT-PCR 测定靶基因表达水平并进行let-7i-3p与靶基因的相关性分析。采用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）转染技术验证靶基因在DOX诱导的心脏毒性中的作用。通过qRT-PCR和蛋白质印迹（ Western blot ）实验进一步验证miRNA对靶基因的调控作用。通过Western blot实验测定哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路上关键蛋白质的表达水平，明确let-7i-3p/mTOR信号通路在DOX诱导的自噬失调中的作用。采用t检验和单因素方差分析进行统计学分析，数据以平均值±标准误（SEM）表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。 结果： 1. RNA-seq结果显示，在使用DOX处理后的AC16细胞中，共发现24个差异表达的miRNA （ Differentially expressed miRNA ， DE miRNA ）和1619个差异表达的mRNA （ Differentially expressed mRNA，DE mRNA），其中20个miRNA表达上调，4个miRNA表达下调；进一步通过qRT-PCR对差异显著的前6个miRNA分子进行验证，结果显示，与对照组相比，DOX显著上调了AC16细胞中let-7i-3p的表达（P＜0.05），上述结果与测序结果一致； 2.使用let-7i-3p mimic和inhibitor转染AC16细胞，成功实现了AC16细胞中let-7i-3p的表达上调和下调。与未转染组和转染阴性对照组相比，在DOX处理后及上调let-7i-3p表达的AC16细胞活力降低，细胞中ROS水平和MDA含量升高，而SOD活性下降，细胞凋亡和自噬增加（P＜0.05）。下调let-7i-3p表达的AC16细胞活力增加，细胞中ROS水平和MDA含量下降，而SOD活性升高，细胞凋亡和自噬减少（P＜0.05）； 3.通过生物信息学软件结合RNA-seq结果我们初步预测核糖体蛋白S6激酶2（ribosomal protein S6 kinase 2，RPS6KA2）是let-7i-3p的靶基因。qRT-PCR和Western blot实验结果显示，上调let-7i-3p的表达之后，RPS6KA2的mRNA表达和蛋白水平发生明显下调，而下调let-7i-3p的表达后，RPS6KA2的蛋白水平发生明显上调。此外，相关性分析结果显示，let-7i-3p与RPS6KA2呈显著负相关（r=-0.80，p＜0.01）； 4.通过 Western blot 实验我们发现 let-7i-3p 不仅可以负性调控RPS6KA2在AC16细胞中的表达，还可通过下调RPS6KA2蛋白表达进而抑制mTOR信号通路，从而介导了DOX诱导下AC16细胞的自噬增加。 结论： 1. let-7i-3p在DOX处理前后的AC16心肌细胞中具有明显表达差异； 2. let-7i-3p降低了DOX处理条件下的AC16细胞活力，促进了AC16细胞中的氧化应激、凋亡和自噬； 3. let-7i-3p通过负性调控RPS6KA2加重了DOX诱导的心脏毒性，这部分是通过促进心肌细胞中的氧化应激、凋亡以及mTOR信号通路介导的自噬而实现的。
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