摘要
全球气候的加剧变化而造成的土壤盐渍化严重影响了我国粮食的生产安全与经济发展。水稻作为一种重要的经济作物，在盐胁迫下，生长和发育不仅受到抑制，而且体内许多重要基因的表达受到影响。本研究通过挖掘与水稻盐胁迫相关基因，利用生物化学、生理学和分子生物学手段揭示其作用机制，为改良水稻品种的耐盐性，提高水稻产量与品质提供理论基础。 RNA解旋酶（RNA helicase，RH）是一类解开双链RNA二级结构，使RNA形成正确折叠的重要酶类。RNA解旋酶参与RNA代谢和功能的各个方面，在调节植物生长、发育、环境胁迫响应等过程中发挥着重要的作用。在真核细胞降解中，大部分细胞质中mRNA的poly（A）尾部通常先经过脱腺苷酸化作用启动5''-3'' mRNA降解途径，之后 mRNA 再经历脱帽反应，此过程需要多种脱帽因子的参与。DEAD （Asp-Glu-Ala-Asp）-box RNA helicase 6（DHH1/DDX6）为脱帽因子，参与5''-3'' mRNA降解途径。迄今为止，上述有关DHH1/DDX6-like RNA解旋酶参与拟南芥介导的非生物胁迫（干旱）反应已有零星报道，但在水稻中相关生物学功能及调节机制尚未见报道。本文对水稻DHH1/DDX6-like RNA解旋酶RH6及同源基因RH8在调节水稻耐盐胁迫反应及相关机理作了初步探索和研究，结果如下： 首先，同源性比较分析发现OsRH6与拟南芥AtRH6和AtRH8的序列相似度分别为73.48%和80.59%；OsRH8与AtRH8和AtRH6的序列相似度为81.80%和74.48%。表明RH6/RH8在水稻与拟南芥两物种间具有较高的同源性。进一步分析得知OsRH6和OsRH8也具有很高的同源性（达到89.59%）。OsRH6和OsRH8均含有DEXDc和HELICc两个保守结构域。全生育RT-PCR分析显示，OsRH6和OsRH8在水稻营养生殖期和孕穗期主要在根和叶鞘中表达；在花期主要在节点表达；在成熟期主要在根和种皮中表达；在水稻的整个生理期，OsRH6和OsRH8在叶片的组成性表达量都较低。在干旱胁迫下，OsRH6和OsRH8的转录表达在根和叶中没有显著差异，而在盐胁迫下，OsRH6和OsRH8的转录表达在根部被诱导上调，在叶中没有显著差异。烟草亚细胞定位结果显示，OsRH6 和 OsRH8 均位于细胞核和加工小体（Processing-body, P-body）。 为进一步研究 OsRH6 和 OsRH8 在盐胁迫下的功能，构建了 OsRH6-Cas9 和OsRH8-Cas9单敲除植株，OsRH6/8-Cas9双敲除植株，OsRH6和OsRH8过表达植株（OE），获得了相应纯合（T3）的水稻转基因材料。分别选择三个株系进行盐胁迫处理。结果显示，与野生型（Wild-Type, WT）相比，OsRH6-Cas9植株对盐不敏感，主要表现为生物量（株高，干重）增大，生理盐毒害（以电导率和丙二醛，Malondialdehyde， MDA表示）降低；OsRH8-Cas9植株生长表型没有明显差异，但电导率和MDA含量降低。OsRH6/8-Cas9植株对盐不敏感，主要表现在叶片焦灼程度小，株高升高，干重增加，叶绿素含量升高，电导率和MDA含量降低，细胞损伤程度更小。相反OsRH6和 OsRH8 过表达植株对盐胁迫更敏感，主要表现为株高降低，干重减少，叶绿素含量下降，电导率和MDA含量增加，细胞损伤程度更大。 通过ICP-MS测定水稻中Na+和K+的积累量，结果发现，在盐胁迫下，与WT相比，OsRH6-Cas9和OsRH8-Cas9敲除株系茎叶中积累了较少的Na+，K+含量无明显差异，K+/Na+值升高，OsRH6-Cas9敲除株系在根部积累较少的Na+，K+含量无明显差异， OsRH8-Cas9敲除株系在根部积累较少的K+，Na+含量无明显差异，根部K+/Na+值升高。OsRH6/8-Cas9 敲除株系在茎叶和根中都积累较少的 Na+，K+含量无明显差异， K+/Na+值升高。而OsRH6和OsRH8过表达株系与OsRH6-Cas9和OsRH8-Cas9敲除株系结果相反。综上所述，OsRH6和OsRH8敲除株系能提高水稻对盐胁迫的耐受性，两者相比，OsRH6敲除对盐的耐受性更大；与单基因敲除材料相比，双基因敲除更能提高水稻对盐胁迫的耐受能力。 正常条件下，OsRH6-Cas9、OsRH8-Cas9 和 OsRH6/8-Cas9 敲除株系种子的发芽时间较WT明显变慢，但在外源ABA处理条件下，同一时间与WT相比，OsRH6-Cas9、OsRH8-Cas9和OsRH6/8-Cas9敲除株系可以提高种子的发芽率。 通过双分子荧光互补技术(Bimolecular Fluorescence Complementation，BiFC)，发现OsRH6、OsRH8和OsRH12三者之间在植物活体细胞内可以发生相互作用，但蛋白互作后OsRH6和OsRH8在细胞内的位置发生改变，原本定位在细胞核和P-body，蛋白互作后只定位在P-body。OsRH6和OsRH8能够分别与拟南芥AtDCP5（Decapping 5）在植物活体细胞内发生蛋白相互作用，其过程是一个动态的过程。 转录组测序结果表明，盐胁迫下 OsRH6/8-Cas9 敲除株系与野生型水稻相比，一些参与抗氧化酶代谢、细胞保护蛋白代谢（如渗透蛋白）以及对盐胁迫响应等抗盐相关基因的表达出现了差异。GO 富集分析表明，差异表达基因在生物学过程中，主要与胁迫响应和代谢过程有关；在分子功能方面，主要功能有激酶活性，催化活性和转移酶活性；在细胞组分中，主要与膜成分有关。KEGG显著性富集分析表明，差异表达基因主要参与植物病原菌互作，光合作用，植物激素信号转导和MAPK信号通路。
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