摘要
一、研究背景及目的: 肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球癌症死亡三大主要原因之一,虽然近年来大多数癌症的死亡率在下降，但HCC的发病率和死亡率仍不断上升，是全球癌症相关死亡中增长最快的癌症。适用于根治性切除的患者数量有限且术后患者的长期生存率通常受到高复发性的影响，5年内复发率高达40％-70％。大多数HCC患者在诊断时处于晚期阶段，不可切除的HCC患者5年生存率仅12％。肿瘤抑制基因失活、癌基因激活、分子信号通路的异常激活等多种因素都会导致HCC的发生。因此，探寻新型有效治疗靶点和用于早期诊断及预测预后的分子生物标志物则显得尤为重要。 环状RNA(CircularRNA,circRNA)可作为转录调节因子、微小RNA(microRNA,miRNA)海绵、蛋白质支架和编码蛋白，在肿瘤发生和进展中发挥重要功能。相关研究显示circRNA与HCC患者预后明显相关，在HCC细胞增殖、转移、免疫逃逸和耐药中起重要的生物学功能，并有可能成为癌症诊断、预后、治疗的生物标志物。 本课题通过复发和未复发HCC患者癌和癌旁组织多组学测序数据寻找相关circRNA,分析其与临床HCC患者预后相关性，并探讨其在HCC进展中的生物学作用和机制。 二、研究方法: 1.HCC相关circRNA的筛选与鉴定:应用转录组测序(RNA sequencing,RNA-Seq)、小 RNA 测序(Small RNA sequencing,small RNA-Seq)和 circRNA-Seq(CircularRNA sequencing,circRNA-Seq)等技术对HCC术后患者癌和配对癌旁组织开展多组学测序，应用生物信息学方法开展HCC相关circRNA分子的筛选;应用PCR扩增、Sanger测序和RNaseR酶消化等鉴定circRNA的存在;针对circRNA的环化位点设计特异性探针和引物，应用qPCR方法检测HCC患者癌组织和配对的癌旁组织中circRNA的表达，应用Kaplan-Meier生存分析和Cox风险回归模型分析circRNA与HCC患者预后相关性。 2.HCC相关circRNA体内外实验:在Huh7和SK-Hep-1肝癌细胞系中构建circRNA稳转过表达细胞株和通过小干扰RNA(Small InterferingRNA,siRNA)沉默circRNA的表达进行细胞层面的评价;通过CCK8实验、划痕实验、Transwell实验、流式细胞实验等表型实验阐明circARSB对HCC细胞增殖、侵袭、转移、周期等生物学功能的影响;通过构建裸鼠皮下荷瘤模型，验证circARSB在体内对HCC肿瘤生长的作用。 3.circRNA蛋白翻译功能的验证:应用生物信息学方法分析circRNA序列中开放阅读框(Open reading frame,ORF)和内部核糖体进入位点(Internal ribosomal entry site,IRES)的位置，通过ORF Finder预测目的蛋白的氨基酸序列和大小;应用Western blotting验证目的蛋白的大小;通过免疫沉淀联合质谱检测鉴定目的蛋白;通过双荧光素酶报告实验验证IRES功能。 4.circRNA上游调控转录因子的筛选与验证:使用Motevo软件预测上游调控转录因子;染色质免疫共沉淀测序(Chromatin Immunoprecipitation-sequencing,ChIP-Seq)联合双荧光素酶报告实验验证上游调控因子。 5.采用转录组测序联合miRNA和mRNA测序数据分析circRNA下游靶基因和信号通路;采用Western blotting验证可能调控的相关信号通路。 三、研究结果: 1.本课题的第一部分是HCC相关circRNA的筛选与验证。通过对HCC患者癌和配对癌旁组织三种组学测序数据进行系统性生物信息学分析，筛选到在HCC组织中高表达的circARSB。circARSB由ARSB的转录本NM198709的2～5号外显子转录剪接形成。通过PCR后Sanger测序，证实circARSB的环化位点，表明circARSB是存在于HCC中的circRNA。 2.本课题的第二部分是circARSB的表达与HCC预后相关分析。我们在110位HCC患者术后的癌和配对癌旁组织进行circARSB相对表达量的检测，并与这些患者的临床病理信息及预后信息结合分析。分析发现，circARSB高表达患者的无复发生存(Recurrence Free Survival,RFS)期和总生存(Overall Survival,OS)期均低于circARSB低表达患者，两者间存在显著差异。多因素Cox回归分析显示circARSB表达量和微血管侵犯(Microvascularinvasion,MVI)是影响患者总生存和无复发生存的独立危险因素。 3.本课题的第三部分是circARSB促进HCC进展的体内外实验验证。在细胞实验上，circARSB过表达的HCC细胞增殖、迁移和侵袭能力显著增强，S期细胞明显增多;沉默circARSB后则产生相反的结果。体内实验显示，circARSB过表达的裸鼠皮下荷瘤生长速度和大小均明显增高。 4.本课题第四部分是circARSB编码蛋白促进HCC进展的验证。生物信息学分析发现circARSB含有ORF和IRES,能够编码321个氨基酸序列的新蛋白circARSB-321aa(35.6kD)。circARSB的ORF从第311个碱基开始，终止于第1276个碱基。通过Western blotting实验检测到ARSB编码蛋白和circARSB-321aa蛋白。使用特异性识别亲本基因ARSB的N端序列的抗体(和circARSB-321aa有相同序列)进行免疫沉淀富集circARSB-321aa蛋白，并将富集到的对应大小的条带进行蛋白质谱检测证实内源性存在。双荧光素酶报告实验证实位于circARSB序列的1030-1208之间的IRES具有启动翻译的能力。将circARSB具有编码蛋白功能的ORF序列构建到线性载体中并转染SK-Hep-1细胞。与对照组相比，circARSB-321aa蛋白具有促进SK-Hep-1细胞的增殖、侵袭和迁移的功能，表明circARSB编码的蛋白circARSB-321 aa在HCC中具有促癌作用。 5.本课题的第五部分是circARSB促进HCC进展的调控机制研究。首先使用Motevo软件预测上游调控circARSB转录的调控因子，结合TCGA数据库中HCC测序数据，对转录因子的差异性以及与HCC患者预后的关联性进行计算分析，筛选到可能的调控因子Kruppel样因子4(Kruppel LikeFactor 4,KLF4)。通过在肝癌细胞系HepG2中过表达KLF4并进行ChIP-Seq验证上游调控机制，结果显示KLF4可以结合ARSB基因启动子区域并调控circARSB的产生。通过转录组测序进行GO和KEGG富集分析，寻找到circARSB可能影响的下游靶基因和信号通路。在GO富集分析中富集到了腺苷酸环化酶激活G蛋白、细胞外基质结合、cGMP结合等条目，提示circARSB可能参与基因转录调控。KEGG通路富集显示circARSB可能参与肿瘤相关通路的调控，如cAMP信号通路、cGMP-PKG信号通路、MAPK通路和PI3K/AKT通路等肿瘤相关通路。Western blotting结果表明沉默circARSB的表达后磷酸化PI3K(p-PI3K)和磷酸化AKT(p-AKT)均出现下调情况。 四、研究结论: 我们首先通过多组学测序证明circARSB在HCC组织中高表达，circARSB的表达量与HCC患者的RFS和OS呈负相关，表明circARSB具有作为HCC预后标志物的可能。其次，通过体内外实验证实过表达circARSB能促进HCC细胞的增殖、侵袭、迁移，其编码蛋白circARSB-321aa在HCC细胞中也发挥着促癌作用。最后通过软件预测和相关实验证实了 KLF4可以结合ARSB基因启动子区域并调控circARSB的形成;转录组测序结合Western blotting实验证实circARSB可能通过调控PI3K/AKT通路促进HCC进展。本课题揭示了 circARSB在HCC进展中的功能和机制，并可能作为预测HCC患者预后的指标。
NETL