摘要
空肠弯曲菌是一种常见的人兽共患病原菌，在禽类及禽类制品中广泛存在，可引起人的肠道疾病。家禽养殖中抗生素的大量使用导致空肠弯曲菌多重耐药问题日益严重，亟需新型的抗菌制剂。噬菌体是一种细菌病毒，可以特异性识别并裂解空肠弯曲菌。相比于抗生素，噬菌体制剂具有更多的优势，如使用简便、特异性强、增殖速度快等。但由于噬菌体对宿主的专噬性，导致其裂解谱窄，在应用中受到诸多限制，而噬菌体自身的生物学特性与其生存环境、侵袭宿主菌等密切相关，因此，筛选出具有不同生物学特性的噬菌体并将其组合起来才能满足实际应用需求。 本研究使用不同基因型空肠弯曲菌进行初筛和复筛得到6株裂解谱广、裂解能力强的空肠弯曲菌噬菌体，对其生物学特性进行鉴定，在此基础上，构建不同的噬菌体组合应用于肉鸡养殖生产中，探索噬菌体接种的最佳浓度、最佳模式，为噬菌体的应用和空肠弯曲菌的防控提供新思路。 一、空肠弯曲菌噬菌体组合的筛选及鉴定 根据空肠弯曲菌不同基因型来筛选噬菌体，测定噬菌体的生物学特性，将具有不同特性的噬菌体进行组合，以满足后续应用的需求。使用20株不同基因型、不同宿主分离的空肠弯曲菌作为测试菌株对58个噬菌体进行初步筛选，根据噬菌体裂解谱和裂解程度得到14株噬菌体。之后，使用肉鸡养殖场分离的12株空肠弯曲菌对初筛的14株噬菌体进行复筛，最终选择出6株裂解能力强，裂解谱广的噬菌体13、35、P14、P53、P81 和 P152 进行组合。 在噬菌体的组合中，测定了噬菌体的生物学特性包括裂解谱、形态学、最佳感染复数、一步生长曲线、热稳定性、酸碱稳定性以及消毒剂耐受程度。选择的6株噬菌体都能大量扩增并形成清晰透明的噬菌斑，且都属于肌尾病毒科，噬菌体的最佳感染复数为0.1和0.01。6株噬菌体的潜伏期较短为35-45 min,裂解期较长为60-110 min,噬菌体P53和P152表现出较高的裂解活性，其裂解量达到300 PFU/cell。噬菌体的最适生长温度在50℃以下，噬菌体35、P152耐高温程度较强，在70℃处理1h后仍具有1×102PFU/mL的效价。噬菌体对pH的耐受性强，在pH 3-12的环境中仍能保持一定的效价，P14和P81两株噬菌体相较而言耐酸性较差。用养鸡场中常用的几种消毒剂（乙醇、异丙醇、甲醛、次氯酸钠）来处理噬菌体，不同的消毒剂对噬菌体的灭活情况也不一样，甲醛效果最好，10％浓度的甲醛能够完全灭活噬菌体，其次是次氯酸钠，需要的浓度为500mg/L,而异丙醇和乙醇效果较差，只有在浓度达到50％以上时才会将噬菌体彻底灭活，其中噬菌体35和P81对不同消毒剂的耐受程度较高。多噬菌体混合后对空肠弯曲菌的消减效果要显著好于单噬菌体（p＜0.001）并能有效地减少抗性菌株的产生，并且使用3个及以上的噬菌体进行组合后消减效果要更稳定。根据对6株噬菌体测定的生物特性，将其分类组合，最终得到了4个噬菌体组合，分别为:组合 1（35、P53、P152）、组合 2（35、P14、P81）、组合 3（13、P81、P152）和组合 4（13、P14、P53）。 二、空肠弯曲菌噬菌体组合在肉鸡养殖环节的应用 通过体内与体外试验评价噬菌体组合对空肠弯曲菌的消减效果，并进一步探索噬菌体在肉鸡养殖环节中的不同应用途径。4个噬菌体组合对不同鸡源的空肠弯曲菌的裂解率可以达到80％以上，在体外对空肠弯曲菌的消减量达2lg值以上，最高可达到4lg值，并且在24 h内有效的抑制空肠弯曲菌的生长。 在体内试验中，向肉鸡饮水中加入养殖场分离的菌株85,连续添加1周后，其泄殖腔中的空肠弯曲菌稳定在1×107CFU/g。不同的噬菌体组合接种后，肉鸡粪便中的空肠弯曲菌载菌量均呈下降趋势，6-10天时载菌量下降最大为2.43lg值，12天时载菌量开始上升并趋于稳定，噬菌体组合1对肉鸡体内空肠弯曲菌的消减效果更好。试验结果表明，不同的饲喂模式（直接口服、一日饮水、持续饮水）接种噬菌体组合1,不会影响噬菌体对空肠弯曲菌的最大消减量，直接口服噬菌体可以较快降低粪便中空肠弯曲菌的载菌量，持续饮水饲喂适合大规模使用。另外，为了有效地消减空肠弯曲菌，至少需要接种105PFU/mL的噬菌体。不同肠道内空肠弯曲菌的定殖量存在差异，空肠、盲肠和结肠内容物中平均定殖量分别为2.6×102、7.4×107和3.9×106 CFU/g,噬菌体组合1能够在肠道内持续存在，并且使盲肠中的载菌量减少2.5 lg值，结肠减少1.9lg值。
NETL