摘要
目的：探讨在高糖环境下心肌细胞缺血再灌注损伤过程中，利拉鲁肽的保护作用，并探讨利拉鲁肽在这一作用中可能的分子机制。 方法：1．将C57BL/6小鼠分为4组，分别为对照组（Con）、糖尿病组（DM）、糖尿病缺血再灌注损伤组（DM+I/R）和利拉鲁肽干预组（DM+I/R+Lir）。采用30mg/kg STZ腹腔注射复合高脂饮食诱导建立小鼠糖尿病模型，200μg·kg-1利拉鲁肽皮下注射干预。干预 4 周后建立心肌缺血再灌注模型，测定小鼠体重、空腹血糖，运用小动物超声成像系统测量心功能，采用伊文思蓝-TTC双染色法检测心肌梗死面积，HE染色观察心肌细胞形态，采用Western blot法和免疫荧光法检测心肌组织中自噬相关蛋白LC3 A/B和p62表达情况，采用Western blot法检测AMPK/mTOR信号通路中AMPK、mTOR蛋白的表达及其磷酸化情况；2．体外实验中将大鼠心肌细胞（H9C2）分为6组，分别为对照组（Con）、高糖组（HG）、高糖缺血复氧组（HG+H/R）、利拉鲁肽干预组（HG+H/R+Lir）、利拉鲁肽+Compound C 处理组（HG+H/R+Lir+CC）和利拉鲁肽+雷帕霉素处理组（HG+H/R+Lir+Rap）。运用 25mM 高糖培养基培养心肌细胞建立高糖模型，分别加入AMPK抑制剂Compound C或mTOR抑制剂雷帕霉素处理细胞，加入200nM利拉鲁肽干预，运用细胞缺氧装置建立细胞缺氧/复氧损伤模型。运用CCK8试剂盒检测H9C2细胞活力，采用Western blot法、免疫荧光法检测H9C2细胞中自噬相关蛋白LC3 A/B和p62表达情况，Western blot法检测AMPK/mTOR通路中AMPK、mTOR蛋白的表达及其磷酸化情况。 结果：1．利拉鲁肽对小鼠血糖及体重的影响。心肌缺血再灌注损伤情况下，其发挥的作用。（1）C57BL/6小鼠糖尿病模型建立实验中，与Con组比较，DM组小鼠血糖增加[（7.05±0.20）vs（9.21±0.42），P＜0.05]，表明小鼠糖尿病模型建立成功。利拉鲁肽干预后，与DM+I/R组比较，DM+I/R+Lir组小鼠血糖[（9.93±0.16）vs（8.56±0.20），P＜0.05]及体重降低[（32.48±0.75）vs （28.89±0.61），P＜0.05]，表明利拉鲁肽能够降低糖尿病缺血再灌注小鼠的血糖及体重。（2）小鼠心功能检测结果显示，与 DM+I/R 组比较，利拉鲁肽干预组小鼠LVEF升高[（33.71±3.48）vs（52.20±3.30），P＜0.05]，LVESD降低[（3.42±0.13） vs（2.55±0.12），P＜0.05]，LVESV降低[（48.11±1.96）vs（23.73±2.71），P＜0.05]，表明利拉鲁肽能够改善糖尿病缺血再灌注损伤小鼠的心功能。（3）心肌梗死面积检测结果显示，与DM+I/R组比较，DM+I/R+Lir组心肌梗死面积下降[（67.18±3.81）%vs （32.63±14.92）%，P＜0.05]，表明利拉鲁肽能够减少糖尿病缺血再灌注损伤小鼠的心肌梗死面积。（4）Western Blot检测自噬及AMPK/mTOR信号通路相关蛋白结果显示，与DM+I/R组比较，DM+I/R+Lir组LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高，p62蛋白表达降低，表明利拉鲁肽能够促进糖尿病缺血再灌注损伤小鼠心肌的自噬，p-AMPK/AMPK比值升高，p-mTOR/mTOR比值下降（P＜0.05），表明利拉鲁肽能够激活糖尿病缺血再灌注损伤小鼠心肌的AMPK/mTOR信号通路。2．利拉鲁肽对高糖缺氧/复氧损伤的心肌细胞自噬水平及AMPK/mTOR信号通路的影响。（1）通过观察细胞形态及CCK-8检测H9C2细胞活力结果显示，与HG+H/R组比较，HG+H/R+Lir组受损的细胞形态有所改善，细胞活力增加[（0.48±0.04）vs（0.73±0.08），P＜0.05]，表明利拉鲁肽能够减轻 H9C2 高糖 H/R 损伤，增加细胞活力。（2）通过 Western Blot检测自噬及 AMPK/mTOR 信号通路相关蛋白结果显示，与 HG+H/R 组比较， HG+H/R+Lir组，LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高，p62蛋白表达水平下降（P＜0.05），表明利拉鲁肽能够促进高糖环境下缺氧/复氧损伤的心肌细胞的自噬，p-AMPK/AMPK比值升高，p-mTOR/mTOR比值下降（P＜0.05），表明利拉鲁肽能够激活高糖环境下缺氧/复氧损伤的心肌细胞的AMPK/mTOR信号通路。在AMPK抑制剂Compound C处理后，部分逆转了这些作用，mTOR抑制剂雷帕霉素处理后，则促进了这些作用，表明利拉鲁肽通过AMPK/mTOR信号通路作用于高糖缺氧/复氧损伤的 H9C2细胞。 结论：利拉鲁肽对糖尿病小鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用，该作用通过激活AMPK/mTOR信号通路促进自噬减轻糖尿病心肌缺血再灌注损伤，为临床糖尿病状态下缺血再灌注损伤的防治和进一步提高患者预后及生存率提供了理论依据。
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