摘要
据2021年国际葡萄与葡萄酒组织统计，中国葡萄种植面积达78.3万公顷，位列全球第三。中国的葡萄酒产量估计5.9亿升，约占全球葡萄酒总产量的2.27％。而葡萄果实中类黄酮酚类物质含量与葡萄植株抗逆性、葡萄果实品质及葡萄酒品质密切相关。葡萄中的类黄酮物质，如原花色素和花色苷，可以提高葡萄植株抗性和葡萄酒的色泽、口感等品质，对葡萄果实及葡萄酒的色泽外观品质和抗氧化的保健价值具有重要作用。前人研究证实，水杨酸（SA）能够促进葡萄果实类黄酮酚类物质积累，但关于其背后的分子机制尚未清楚。WRKY26在矮牵牛、油菜、拟南芥中的同源基因可以调控矮牵牛（PhPH3,AMR43368）、油菜（基因BnTTG2,AJD07412.1）、拟南芥（基因 AtTTG2,AT2G37260）等植物中原花色素和花色苷的积累，且葡萄 VvWRKY26可能参与了 SA调控原花色素物质积累。但VvWRKY26调控原花色素的生物学功能，特别是其在SA调控葡萄原花色素生物合成中的分子机制尚不明确。本文以‘无核早红’转色期葡萄果实为试材，采用外源SA渗透孵育、瞬时沉默和过表达以及酵母双杂交等实验方法，探究VvWRKY26调控类黄酮酚类物质积累的生物学功能及其参与SA调控葡萄原花色素生物合成的分子机制。主要结果如下: 1.150 μmol/L SA真空渗透孵育转色期无核早红葡萄果实，促进了葡萄果实类黄酮代谢。外源SA促进类黄酮代谢途径中结构基因（如VvPAL、VvCHI)及相关转录因子（VvMYCA1、VvMYBPA1、VvMYBPA2、VvMYB5b、VvWDR1、VvWDR2)的转录表达。外源SA促进PAL酶、ANS酶、ANR酶、LAR酶活性提高。外源SA促进转色期葡萄果实中总酚、总类黄酮、总黄烷醇、原花色素、花色苷及儿茶素和表棓儿茶素、等物质的积累。 2.VvWRKY26基因的CDS区长度为1434 bp,生物信息学分析表明，VvWRKY26与拟南芥AtTTG2、矮牵牛PhPH3、油菜BnTTG2同源性较高，保守基序组成和分布模式与矮牵牛PhPH3相似程度最高。表达特性分析结果表明，VvWRKY26在原花色素和花色苷积累关键时期的幼果期和转色期表达量较高，可能参与葡萄花色苷和原花色素合成。启动子分析发现，VvWRKY26启动子区域存在4个响应SA的顺式作用元件。SA处理后Vv WRKY26的表达量上调，证明 VvWRKY26能够响应SA信号分子。 3.VvWRKY26通过上调VvDFR、VvANS、VvANR的表达量，促进葡萄原花色素积累。转色期葡萄果实过表达Vv WRKY26后，果实表面红绿值（a*值）、果实中原花色素含量均极显著高于对照，果实中VvDFR、VvANS、VvANR基因表达量上升。葡萄叶片过表达VvWRKY26后，DMACA染色的蓝色面积大于对照，原花色素含量高于对照，叶片中VvDFR、VvANS、VvANR基因的表达量上升。 4.VvWRKY26通过下调VvDFR、VvANS、VvLAR2的表达量，抑制了葡萄原花色素积累。转色期葡萄果实中沉默VvWRKY26后，VvDFR、VvANS基因表达量均下降，果实表面红绿值下降，原花色素含量下降。在葡萄叶片中沉默Vv WRK126后，叶片中VvDFR、VvANS、VvLAR2基因的表达量均下降，沉默后叶片DMACA染色结果中蓝色部分面积低于对照，原花色素含量低于对照。 5.酵母双杂交试验结果显示，VvWRKY26蛋白与VvMYBPA1、VvMYBPA2、VvMYC2蛋白均能在酵母体内发生互作。推测VvWRKY26通过与介导SA调控类黄酮积累的MYBPA1、MYBPA2互作来参与SA正调控原花色素积累。VvWRKY26通过与VvMYBPA1、VvMYBPA2、VvMYC2作用形成复合物从而调控下游VvDFR、VvANS、VvANR、VvLAR2结构基因的表达量来调控葡萄原花色素的积累。 综上，150μmol/L的SA促进了葡萄果实中类黄酮酚类物质积累。VvWRKY26通过调控VvDFR、VvANS、VvANR、VvUFGT的表达量调控葡萄果实和叶片中原花色素的合成。VvWRKY26参与了 SA促进葡萄果实原花色素积累机理如下:VvWRKY26通过与VvMYBPA1、VvMYBPA2、VvMYC2蛋白相互作用，调节原花色素和花色苷相关结构基因进而调节原花色素的积累。
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