摘要
抗生素在饲料行业的长期不合理使用,带来了动物健康水平降低、致病菌耐药性增强、畜禽食品药物残留超标等问题.2020年抗生素被禁止用作饲料添加剂,抗生素的禁用,必然对动物的生长性能和健康水平产生一定的影响,因此抗生素替代产品的研发,提高营养物质的消化率,对于促进养殖业持续、健康、绿色发展具有重要的意义.具有抗菌、抗氧化等多功能的发酵饲料是替代抗生素的最佳方案之一.发酵饲料富含有益微生物及代谢产物,营养物质可消化吸收率高,能够有效提升饲料营养和功能品质.不同菌种和发酵工艺获得的发酵产品中微生物和代谢产物不同,功能各异,功能代谢产物代谢途径不清晰,难以实现对于发酵过程的精准调控和优化.因此,本文以提升发酵饲料功能性和品质为最终目的,综合利用多种理化检测方法并联合应用基于超高液相色谱-质谱联用技术(UHPLC-MS/MS)的代谢组学和基于16S rDNA测序的微生物多样性分析等多组学策略,分析发酵过程中物质与功能之间、微生物和代谢产物及功能之间的相关性,探索发酵对于饲料功能的影响机制.主要研究结果如下: 以酸溶蛋白与粗蛋白的比值作为考察指标,优化了发酵菌剂中不同功能菌株的组合为:FM-18菌株2.86×108 CFU/g、JA-14菌株2.86×108 CFU/g、DB-7-6菌株4.28×108 CFU/g,并采用单因素试验和响应面法,确定了饲料发酵工艺条件为:接种量1×109 CFU/Kg(干物质)、含水量43%、发酵温度34℃、发酵时间14 d,最终发酵产物的酸溶蛋白/粗蛋白达到(31.82±1.75)%.与优化前相比,提高了5.31个百分点. 采用多种理化检测方法对于发酵过程中不同样本的物理状态、蛋白组成、各物质含量及抗菌、抗氧化等功能进行了检测和分析.随着发酵的进行,发酵产物颜色变深,电镜观察发现,发酵后的饲料更加的细碎,表面出现了细微的孔洞.pH 值持续下降,有机酸含量持续上升,酸香味明显.蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶活力显著高于未发酵样本(Plt;0.05).氨基酸总含量和必需氨基酸含量分别增加了7.11倍和8.56倍.大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白分别降低了82.36%和80.65%,抗原活性显著降低(Plt;0.05).发酵产物抗菌、抗氧化等功能极显著提高(Plt;0.001).酸溶蛋白/粗蛋白、消化酶活力、有机酸含量、pH 值、抗原蛋白含量与发酵样品的抗菌及抗氧化性能均呈极显著的相关性(Plt;0.001).主成分分析和综合评价指数分析发现,发酵4 d内,样本变化较大,发酵10 d后,无显著差异. 采用碱溶酸沉法提取粗蛋白并对其进行检测和分析.电镜观察发现,发酵后提取的粗蛋白,结构更加疏松和细碎,表面有细微孔洞,不规则结构增多.SDS-PAGE凝胶电泳结果表明,β-伴大豆球蛋白的α和α′亚基组分降解最为充分,尤以发酵前4 d降解速率最快.FT-IR分析发现,发酵后提取的粗蛋白α-螺旋比例下降,β-折叠比例上升.通过微生物降解,粗蛋白结构和性质发生较大变化,水溶性提高. 基于UHPLC-triple-TOF-MS/MS系统对于发酵饲料中的物质进行分离和鉴定,共发现1425个代谢产物,其中583个具有显著差异.多种具有功能的代谢物质含量增加,如具有抗菌活性的Val-Arg、亚油酸类物质,具有抗氧化活性的Leu-Pro-Phe、酚酸、5-羟基黄酮等,带有谷氨酸残基的小肽等.差异代谢产物主要集中在D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢;丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢、半乳糖代谢和三羧酸循环.微生物组学分析发现,发酵前后微生物组成差异显著.发酵终产物中,厚壁菌门占据绝对优势.魏斯氏菌属、乳杆菌属和片球菌属显著富集.关联分析发现,功能物质含量变化与优势菌属、抗菌及抗氧化功能极显著正相关(Plt;0.001).将发酵饲料用于蛋鸡养殖后,对其肠道内容物的微生物组成和物质变化进行了分析,结果发现,厚壁菌门相对丰度上升,差异代谢产物参与的代谢通路中氨基酸代谢通路和植物消化代谢通路显著富集,对于鸡生长性能的提高具有促进作用.本研究初步明确了复合菌剂发酵饲料抗菌抗氧化功能的产生机制,为发酵饲料的品质评价及质量精准调控提供了参考,为获得功能性、低抗原性和高消化率饲料的推广应用提供了理论依据.
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