摘要
可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）侵染茶树引起的茶叶斑病是一种新病害，对贵州茶叶的产量和品质影响较大。为有效防控茶树叶斑病，筛选出安全、高效的药剂，以及研究药剂对病原菌的作用机理，对于防治茶叶斑病具有重要的意义。本文聚焦于香芹酚（Carvacrol，car）和麝香草酚（Thymol，thy）对L. theobromae 的抑菌活性评价，通过光学显微镜和扫描电镜初步观察了药剂对L. theobromae外部形态的影响，并且研究了香芹酚和麝香草酚与ctDNA的结合方式以及通过转录组学法研究香芹酚和麝香草酚对L. theobromae的DNA转录片段的影响，初步探索了香芹酚和麝香草酚对L. theobromae的抑菌作用机制。主要研究内容如下： 1. 通过离体抗真菌活性筛选单帖类化合物。结果表明：大部分化合物表现出较好的抑菌活性，化合物麝香草酚（EC50=46.11μg/mL）、香芹酚（EC50=46.85 μg/mL ）、3-甲基-4-异丙基苯酚（ EC50=55.17 μg/mL ）、2,3,5-三甲基苯酚（EC50=119.19 μg/mL）、丁香酚（EC50=193.00 μg/mL）和薄荷醇（EC50=460.55 μg/mL），其中香芹酚和麝香草酚表现出较优异的抑菌活性。 2. 通过形态学进一步研究香芹酚和麝香草酚处理L. theobromae的形态影响。结果表明：香芹酚和麝香草酚浓度EC50处理L. theobromae 24 h后，通过光学显微镜观察到菌丝粗细变化明显，菌丝膨胀，菌丝出现不正常的生长；通过扫描电镜观察到部分菌丝表面膨大，有突起和内陷。在药剂EC90处理L. theobromae 24 h后，光学显微镜下观察到菌丝表面变形越明显，部分菌丝分枝减少，菌丝塌陷，出现短粗肿胀现象；扫描电镜的观察下菌丝粗细不均匀，部分菌丝表面有突起、有褶皱、塌陷甚至干瘪变形。 3. 通过多光谱学方法，研究了香芹酚和麝香草酚与小牛胸腺 DNA（Calf thymus DNA，ctDNA）的结合模式和机理。 （1）通过紫外吸收光谱测定药物浓度增加吸收光强度增大，出现增色效应，说明药剂和ctDNA发生了相互作用并以沟槽结合相互作用。 （2）荧光光谱法是利用荧光实验探究反应体系的猝灭机制，计算了香芹酚与ctDNA的结合常数为3.88×106 M、麝香草酚与ctDNA的结合常数为1.04×1010 M，两个小分子Kq 值均大于猝灭剂对生物大分子的最大碰撞猝灭速率常数Kdif，确定了主要作用力类型为沟槽作用，随后通过两个小分子分别与单链 ctDNA 结合后，香芹酚和麝香草酚与单链ctDNA结合常数明显小于与双链ctDNA的结合常数，进一步验证香芹酚和麝香草酚与ctDNA的沟槽结合。香芹酚对DAPI和EB的竞争率分别为17.55%和5.01%，麝香草酚对DAPI和EB的竞争率分别为13.43%和5.44%，说明香芹酚和麝香草酚取代了ctDNA结合的DAPI，也进一步证实了香芹酚和麝香草酚与ctDNA之间的沟槽结合模式。 （3）通过圆二色谱可观察到香芹酚和麝香草酚与ctDNA孵育后，CD信号值变化不明显；同时，4'',6-二脒基-2-苯基吲哚（4'',6-diamidino-2-phenylindole）沟槽结合剂和经典嵌插剂溴化乙锭（Ethidium bromide）与 ctDNA 孵育后，随着DAPI-ctDNA体系增大CD信号值变化不明显，EB-ctDNA体系的增大CD信号出现有规律的下降。而两个小分子与DAPI的规律类似，沟槽以及静电结合对其CD光谱干扰比较小，香芹酚和麝香草酚与ctDNA之间的沟槽结合也呈现类似的结果。 4. 通过转录组学测序的方法进一步研究香芹酚和麝香草酚在不同浓度和不同时间处理L. theobromae后对DNA转录片段的影响。对数据分析表明，药剂处理L. theobromae之后基因片段大小在1,000~2,000 bp区间内最多，影响香芹酚和麝香草酚DNA转录的片段主要集中于片段区间1,000~2,000 bp的上调基因片段中。
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