摘要
目的：1）预测Eg TAK1蛋白的理化和结构特性及生物学功能；2）探究胆汁酸盐刺激后Eg TAK1蛋白对细粒棘球绦虫发育分化的调控作用，为筛选抑制细粒棘球绦虫（Eg）发育分化的靶基因提供理论基础，有助于早期防控病原体环境污染与切断宿主传播。 方法：1）从新疆乌鲁木齐屠宰场自然感染细粒棘球绦虫的绵羊肝脏中采集Eg原头蚴，利用有无牛磺胆酸钠（T4009）的培养基对原头蚴进行培养，对比观察不同时间段的原头蚴的发育状况及形态变化；2）通过普通 PCR 扩增获得 Eg TAK1 ORF全长并测序，利用生物信息学相关软件预测Eg TAK1蛋白的理化和结构特性及生物学功能；3）基于对该蛋白特性与功能的预测，构建重组质粒pET30a-Eg TAK1并在原核表达系统诱导重组Eg TAK1蛋白表达；利用纯化后的重组蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体，ELISA检测抗体血清效价，Western Blotting鉴定并验证多克隆抗体对重组Eg TAK1蛋白的识别；4）通过RT-qPCR和Western Blotting检测Eg TAK1在有无T4009刺激的细粒棘球绦虫不同阶段的表达水平，进一步比较犬胆汁培养和T4009培养培养不同阶段对Eg TAK1 mRNA表达的影响；通过免疫组化确定Eg TAK1蛋白在细粒棘球绦虫中的表达位置；5）根据已克隆测序的Eg TAK1 ORF序列设计 3 种靶向的 siRNA (Eg TAK1-siRNA1—Eg TAK1-siRNA3)、一种阴性对照siRNA (NC siRNA)及Cy3荧光对照，将5种siRNA以5μmol/L的浓度通过电穿孔法分别转染至新采集的细粒棘球绦虫的原头蚴体内，培养 3 天后收集样本，采用 RT-qPCR检测siRNA对靶向基因的干扰效果。 结果：1）无T4009培养的PSC，与第1天相比，第3天包囊形态变大，椭圆形，2周后发育为短粗型；有T4009培养的PSC，第1天处于T4009刺激阶段，第3天外翻率达到40%左右，2周后外翻率达到85%左右；2）经克隆得出Eg TAK1基因ORF全长1116 bp，编码的蛋白含371个氨基酸，预测该蛋白是一种不稳定的亲水性蛋白，具有良好的免疫原性，属于蛋白激酶 C 类似(PKC-like)家族，无跨膜结构域和信号肽，亚细胞定位于细胞膜、细胞质及细胞核内，二级结构以无规则卷曲为主，与多房棘球绦虫的TAK1的序列同源性最高为83%，认为是一种高度保守的激酶；3）重组Eg TAK1蛋白表达呈特异性条带，分子量大小为50 KDa左右；纯化后的血清效价为1：128000，成功制备多克隆抗体；此多克隆抗体可特异性识别免疫原和 Eg TAK1 蛋白；4）在 Eg 发育分化过程中，Eg TAK1 mRNA在Eg生发层表达最低，在35天成虫表达最高，生发层和成虫阶段Eg TAK1 mRNA的表达水平与原头蚴阶段相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）；在体外培养1 d、3 d和17 d时T4009组Eg TAK1 mRNA表达均高于无T4009组，差异有统计学意义（P＜0.05）；在体外培养30 min，3 h和7 d时T4009组Eg TAK1蛋白表达均高于无T4009组，差异有统计学意义（P＜0.05）；犬胆汁培养和T4009培养对于细粒棘球绦虫Eg TAK1 mRNA表达的影响是一致的，差异无统计学意义（P＞0.05），提示犬胆汁中起主要作用的是牛磺胆酸钠盐； Eg TAK1 蛋白主要表达在 PSC 的钙颗粒包膜上，在无胆盐刺激的PSC (3h) 中主要表达在虫体表层的钙颗粒包膜上，在有胆盐刺激的PSC (3h) 中主要表达在虫体头节的钙颗粒包膜上；在 35 天成虫阶段表达在虫体的头节以及未成熟的节片中，也主要表达在虫体的钙颗粒包膜上；5） RNAi 沉默 Eg TAK1 mRNA 表达，Eg TAK1-siRNA1、Eg TAK1-siRNA2、Eg TAK1-siRNA3转染组及NC组表达水平相对于未处理组（UT）分别降低了76%、42%、19%和12%，siRNA1降低最显著，差异有统计学意义（P＜0.05）。 结论：本研究首次预测了Eg TAK1蛋白的理化特性和生物学功能；初步验证Eg TAK1蛋白在Eg发育分化中具有一定的促进作用。Eg TAK1蛋白有可能是抑制Eg发育的干预靶点之一，可为阻滞细粒棘球绦虫发育分化，切断宿主传播提供理论基础。
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