摘要
肌纤维类型是影响猪肉品质的主要因素之一。课题组前期研究了香猪和大白猪背最长肌转录组，发现硒蛋白W（Selenoprotein W，SELW）在酵解型肌纤维含量较多的大白猪中高表达，而硒结合蛋白1（Selenium binding protein 1，SBP1）在氧化型肌纤维含量较多的香猪中高表达。为了探究SELW和SBP1调控猪肌纤维类型的功能及其作用机制。本研究首先确定SELW和SBP1的分子和组织表达特征，进一步构建过表达和干扰慢病毒载体明确SELW和SBP1调控肌纤维类型的功能，接着运用TMT蛋白质组学解析SELW和SBP1调控肌纤维类型转化的相关信号通路。主要结果如下： 试验1. 猪SELW基因组织表达特性及慢病毒载体构建 SELW在猪的心脏和背最长肌中表达量极显著高于其他组织（P＜0.01）。SELW蛋白分子式为C421H677N109O119S3Se1，相对分子量为9344.81Da，理论等电点为9.15，属于稳定蛋白质。遗传进化分析可知猪SELW与人、恒河猴和苏门答腊猩猩相似性最高。亚细胞定位显示SELW蛋白定位于细胞核和细胞质。qPCR和Western blot结果表明SELW-OE组SELW表达量极显著高于SELW-NC组（P＜0.01），筛选出SELW-shRNA 1组干扰效果最佳（P＜0.01）。 试验2. SELW基因调控肌纤维类型转化及蛋白组学研究 Western blot检测4种肌纤维类型蛋白的表达情况。结果显示，与SELW-NC组相比，过表达SELW极显著下调了MYHC Ⅰ和MYHC ⅡA蛋白的表达（P＜0.01），而极显著上调了MYHC ⅡX和MYHC ⅡB蛋白的表达（P＜0.01）。沉默SELW基因的表达极显著上调了MYHC Ⅰ蛋白的表达（P＜0.01），显著上调了MYHC ⅡA蛋白的表达（P＜0.05），而极显著下调MYHC ⅡB蛋白的表达（P＜0.01），对MYHC ⅡX蛋白的表达无显著影响。推测SELW表达促进了肌纤维向快肌转化。TMT蛋白组学结果显示SELW-OE组共鉴定到89个差异蛋白，上调蛋白55个，下调蛋白34个。KEGG富集分析显示DEPs参与了脂肪酸生物合成与降解、PPAR信号通路、Wnt信号通路和钙信号通路等。SELW-sh组共鉴定到46个DEPs，上调蛋白24个，下调蛋白22个。KEGG富集分析显示DEPs参与了NF-κB信号通路、磷酸戊糖途径、PPAR信号通路和AMPK信号通路等。 试验3. 猪SBP1基因组织表达特性及慢病毒载体构建 SBP1在猪的背最长肌中表达量极显著高于其他组织（P＜0.01）。SBP1蛋白的分子式为C2523H3916N678O727S24，相对分子量为56.14839kD，理论等电点为6.40，属于稳定蛋白；遗传进化分析可知猪的SBP1基因与牛亲缘关系最近，与斑马鱼亲缘关系最疏远。亚细胞定位结果表明SBP1蛋白定位于细胞核和细胞质。qPCR和Western blot结果显示SBP1-OE组SBP1表达量极显著高于SBP1-NC组（P＜0.01），筛选出SBP1 shRNA-3组的干扰效果最佳。 试验4. SBP1基因调控肌纤维类型转化及蛋白组学研究 与SBP1-NC组相比，过表达SBP1极显著上调了MYHC ⅡA蛋白的表达（P＜0.01），极显著下调了MYHC Ⅰ蛋白（P＜0.01），而对MYHC ⅡX和MYHC ⅡB蛋白的表达无显著影响。沉默SBP1基因的表达，极显著上调了MYHC Ⅰ和MYHC ⅡB蛋白的表达（P＜0.01），极显著下调MYHC ⅡA蛋白的表达（P＜0.01），而MYHC ⅡX蛋白的表达无显著影响。推测SBP1基因表达促进肌纤维向MYHC ⅡA型转化。TMT蛋白组学结果显示SBP1-OE组共鉴定到32个DEPs，上调蛋白20个，下调蛋白12个。DEPs主要参与细胞过程、对刺激的反应和信号传递等。与分子结构活性、转运活性和催化活性等相关。KEGG富集分析显示主要富集于1条信号通路，即核糖体信号通路。SBP1-sh组共鉴定到78个DEPs，上调蛋白35个，下调蛋白43个。DEPs主要参与细胞过程、代谢过程和对刺激的反应等过程。与催化活性、转运体活动和分子结构活性等有关。富集于6条信号通路：肥大性心肌病（HCM）、心肌收缩、扩张型心肌病（DCM）、心肌细胞中的肾上腺素能信号和细胞粘附分子（CAMs）。 综上所述，本研究检测到SELW在心脏和背最长肌中表达量最高，SBP1在背最长肌中表达量最高。SELW表达促进肌纤维类型向快肌转化，可能参与纤维类型转化的信号通路有PPAR、Wnt、钙离子、MAPK等；SBP1表达促进了肌纤维类型向MYHC ⅡA型转化，可能参与纤维类型转化的信号通路有核糖体信号通路、心肌收缩、肾上腺素能信号和细胞粘附分子等。
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