摘要
水涝胁迫是农业生产上面临的重大隐患，辣椒根系较浅而不耐涝，涝害导致其产量大幅下降，提高辣椒的耐涝性已成为急需解决的问题。随着分子生物学的飞速发展，耐涝基因的挖掘和功能分析已成为研究热点。脱落酸不敏感3/胎生1（ABI3/VP1）蛋白在调节植物生长和应对胁迫方面至关重要，有关辣椒ABI3/VP1基因的研究鲜见报道。‘ZHC2’是一个耐涝朝天椒品种，本试验通过转录组分析，从耐涝性强的‘ZHC2’中鉴定出1个特异性 ABI3/VP1基因，该基因在水涝胁迫下优势表达，可能是响应水涝胁迫的关键基因。本试验对该基因成功克隆，并命名为 CaABI3/VP1-1。为了进一步验证基因的功能，以‘ZHC1’、‘ZHC2’、‘DFZJ’辣椒和本氏烟草为试材，通过基因克隆、序列分析、同源表达、异源表达、亚细胞定位、生理测定以及过表达材料 T3代转录组测序等手段研究该基因对辣椒的调控作用。主要研究结果如下： 1. 通过 qRT-PCR 分析耐涝候选基因 CaABI3/VP1的表达情况，发现其在根、茎和叶的表达趋势一致，均是在淹水后表达降低。在 T2时期，根中表达量下调了62.79%、茎中表达量下调了43.81%、叶中表达量下调了55.36%。这与转录组中变化趋势一致，说明CaABI3/VP1可能在整个植株中均表达。 2. 成功克隆辣椒 CaABI3/VP1-1基因，构建 pEGOEPubi-H-辣椒CaABI3/VP1-1-GFP 载体。CaABI3/VP1-1包含一个1,017 bp 的开放阅读框，编码338个氨基酸。蛋白序列分析表明 CaABI3/VP1-1包含两个保守 B3结构功能域，赖氨酸和谷氨酸是主要氨基酸成分，该蛋白是一个亲水性非分泌蛋白，含有磷酸化位点。蛋白质二级结构中主要构成元件是不规则卷曲。CaABI3/VP1-1与辣椒XP 016577237.2蛋白（LOC107875132）聚在同一个分支，亲缘关系最近。 3. 同源建模揭示了该蛋白的N端有一个α-螺旋链，C端有一个β折叠延伸链构成，该模型置信度为100.0%；蛋白质的Ramachandran图显示氨基酸残基在禁止区域只有1%残留，验证了模型的准确性；进一步对蛋白进行了4 ns 的分子动力学模拟，发现自2,300 ps之后蛋白达到平衡，在3,350 ps达到最大值，波动范围1.174~1.414 nm，表明蛋白结构稳定。 4. 启动子顺式作用元件中包含脱落酸反应相关的 ABRE 元件，与植物激素相关的顺式作用元件有 TGA-element、CGTCA-motif、TATC-box、TGACG；与发育相关的顺式作用元件有GCN4_motif；与逆境相关的顺式作用元件包括LTR、ARE；与代谢相关的顺式作用元件有 O2-site；另外还发现大量保守光调控元件，如G-Box、I-box、Gap-box、GT1-motif、Box 4等。 5. 构建 CaABI3/VP1-1-GFP 载体，利用农杆菌将 CaABI3/VP1-1导入2~4周烟草叶片中进行瞬时表达，通过激光共聚交荧光显微镜检测荧光信号，亚细胞定位显示该蛋白定位在细胞核。也证实了转录因子必须在核内作用，才能起到调控表达的目的。 6. 对CaABI3/VP1-1在‘DFZJ’、‘ZHC1’中同源转化，通过GFP绿色荧光筛选和 PCR检测，成功鉴定了过表达株系。CaABI3/VP1-1过表达株系具有更强的根和茎的生长以及抗倒伏能力；同时提高了植株可溶性蛋白（SP）含量、脯氨酸（ Pro ）含量、气孔密度、气孔孔径，减小了丙二醛（ MDA ）和活性氧（ROS）积累，具有比野生型更高的过氧化氢酶（CAT）活性。进一步通过农杆菌介导的叶盘转化法将 CaABI3/VP1-1转化本氏烟中，CaABI3/VP1-1过表达减轻了植株根系的腐烂程度，同样增强了 SP和 Pro的含量、气孔密度及 CAT活性，减小了植株的MDA积累。 7. T3代转录组分析揭示了LOC107851705、LOC107875640、LOC107840371、LOC107845682、LOC107840535、LOC107846008、LOC107839295 与LOC107843452等可能是 CaABI3/VP1-1互作的关键基因。差异基因主要富集在核糖体、MAPK信号通路-植物、植物激素信号转导等通路。 综上所述，本试验从辣椒‘ZHC2’中克隆了一个 CaABI3/VP1-1基因，水涝胁迫诱导该基因下调表达。CaABI3/VP1-1亚细胞定位于细胞核，通过在辣椒中同源表达和烟草中异源表达，发现其对于提高植株耐涝性具有积极作用。因此，CaABI3/VP1-1参与辣椒的水涝胁迫响应，可能是提高辣椒耐涝能力的一个重要基因。
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