摘要
目的： 肾纤维化(Renal fibrosis,RF)是所有进行性肾脏疾病的常见基础病因，也是慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)进展为终末期肾病(End stage kidney disease,ESKD)的重要病理学基础。中医药理论认为，RF治疗需活血化瘀。雷公藤具有祛风通络的功效，在临床中用于多种肾脏疾病的治疗，同时表现出一定的抑制RF作用，具有良好的开发与应用前景。但目前该中药物质基础及作用机制尚不明确。本研究旨在通过网络药理学分析雷公藤抗RF的物质基础及作用机制;通过体外实验，初步验证雷公藤治疗RF的核心成分及潜在作用机制;通过体内外实验，验证雷公藤甲素抑制Wnt/β-catenin信号通路改善RF的作用机制。 方法： 1.雷公藤抗肾纤维化的网络药理学研究 借助TCMSP和TCMID数据库筛选雷公藤中药所含成分，根据Uniprot数据库获取雷公藤中药所含成分对应的靶点基因;利用GeneCards、DisGeNET、OMIM数据库收集RF相关靶点;将雷公藤对应靶点和RF相关靶点匹配映射，得到雷公藤治疗RF的靶点;利用Cytoscape软件绘制雷公藤核心成分-交集靶点网络图并通过Network Analysis插件分析网络拓扑特征筛选雷公藤的核心成分;将交集靶点导入STRING数据库获取治疗RF的靶点互作信息，导入Cytoscape软件构建蛋白相互作用网络(PPI);利用Metascape数据库对交集靶点进行GO和KEGG富集分析。 2.雷公藤核心成分在HKC细胞改善RF机制研究 以不同浓度的山柰酚(0,5,10,15,20 μmol/L)、β-谷甾醇(0,5,10,15,20μmol/L)、雷公藤甲素(0,5,10,15,20nmol/L)对人肾小管上皮细胞(HKC)进行24 h干预，通过CCK-8实验检测细胞存活率，以最高细胞存活率的药物浓度作为后续实验的给药浓度;采用Western blot法及q-PCR法考察三种核心成分对Wnt/β-catenin信号通路相关靶点PLD-1的调控作用。 3.雷公藤甲素在体内外肾纤维化模型中对肾纤维化的影响及作用机制研究 建立细胞和动物肾纤维化模型。通过TGF-β诱导建立HKC细胞肾纤维化模型。在细胞水平上，采用Western blot、q-PCR等分析方法研究雷公藤甲素对RF相关蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及胶原蛋白Ⅰ(COL-Ⅰ)蛋白及mRNA表达的影响，探讨雷公藤甲素抗RF的作用及其机制。在动物水平上，建立肾缺血再灌注(Renal ischemia-reperfusion injury,RIRI)小鼠模型，实验分为三组：假手术(Sham)组，模型组，雷公藤甲素组(100μg/kg腹腔注射1次/日)，连续给药7 d、14d、21d后处死。收集小鼠肾脏组织和外周血血清，测定血清肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)等指标，对小鼠肾脏组织行HE染色、Masson''s trichrome染色等病理组织染色方法，观察雷公藤甲素对RIRI小鼠肾损伤和肾纤维化的影响。此外，采用q-PCR法及Western blot法检测RF相关基因α-SMA及COL-Ⅰ的表达，并进一步检测Wnt/β-catenin信号通路中PLD-1、β-catenin的表达情况。 结果： 1.雷公藤抗肾纤维化的网络药理学研究 网络药理学结合文献报道筛选获得雷公藤中药的核心成分共27个，相对应的靶基因共133个，RF靶基因3002个，交集基因76个。经过网络拓扑参数筛选后得出雷公藤抗RF的三个核心成分分别为：山柰酚、β-谷甾醇、雷公藤甲素。GO和KEGG富集分析发现雷公藤抗RF涉及Wnt通路等多条信号通路。 2.雷公藤核心成分在HKC细胞改善RF机制研究 CCK-8实验结果显示，与0μmol/L相比，山柰酚浓度≥15μmol/L、β-谷甾醇浓度≥15μmol/L、雷公藤甲素浓度≥10nmol/L时，HKC细胞存活率降低(P＜0.01)。因此，以山柰酚10μmol/L、β-谷甾醇10μmol/L、雷公藤甲素5nmol/L为给药浓度展开后续实验。Westernblot及q-PCR结果发现雷公藤甲素可以显著降低PLD-1蛋白及基因表达水平(P＜0.01)。 3.雷公藤甲素在体内外肾纤维化模型中对肾纤维化的影响及作用机制研究 在细胞水平上，细胞形态学结果表明：与对照组相比，TGF-β组梭形转化增多(P＜0.01);与TGF-β组相比，TGF-β+雷公藤甲素组梭形转化减少(P＜0.01)。此外，Western blot及q-PCR实验结果表明，与对照组相比，TGF-β组α-SMA及COL-Ⅰ等EMT相关蛋白及基因的表达显著上调(P＜0.01),雷公藤甲素组COL-Ⅰ和α-SMA蛋白及基因表达无统计学意义(P＞0.05);与TGF-β组相比，TGF-β+雷公藤甲素组α-SMA及COL-Ⅰ蛋白及基因表达显著下调(P＜0.01)。提示雷公藤甲素对正常HKC细胞的EMT相关蛋白及基因无影响，但对已存在RF发展趋势的HKC细胞EMT相关蛋白及基因表达表现出较强的抑制作用。在动物水平上，通过检测BUN、Scr指标，我们发现与Sham组相比，模型组BUN、Scr指标明显上调;与模型组相比，雷公藤甲素组BUN、Scr指标显著下调。HE染色显示：与Sham组相比，模型组小鼠肾脏组织的肾小管扩张、肾小球萎缩显著增多;雷公藤甲素组显著改善了肾脏组织的损伤。Masson''s trichrome染色提示模型组肾组织较多的胶原沉积、蓝色纤维明显增多;雷公藤甲素组抑制肾间质中的胶原沉积,减轻小鼠肾组织纤维化病理改变。Western blot及q-PCR实验结果表明，与Sham组小鼠相比，模型组α-SMA和COL-Ⅰ的蛋白及mRNA表达水平显著上调(P＜0.01),提示模型组小鼠肾组织发生了明显的纤维化;雷公藤甲素组α-SMA和COL-Ⅰ的蛋白及mRNA表达水平均显著下调(P＜0.01),且随着雷公藤甲素干预时间增长，缓解RF程度增加。q-PCR结果表明：与Sham组比，模型组PLD-1和β-catenin的mRNA表达水平显著增加(P＜0.01);与模型组相比，雷公藤甲素组PLD-1和β-catenin的mRNA表达水平显著下降(P＜0.01)。雷公藤甲素在体内可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路，对EMT相关蛋白的表达表现出较强的抑制作用，达到抗RF,保护肾脏的作用。 结论： 雷公藤中山柰酚、β-谷甾醇、雷公藤甲素等核心成分可调控Wnt等信号通路防治RF的发生发展。体内外实验证实雷公藤甲素作为雷公藤的有效成分可以显著抑制RIRI模型及TGF-β诱导的肾纤维化模型的肾损伤及纤维化，这种保护作用与雷公藤甲素降低PLD-1的表达，抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化并延缓EMT发生发展有关。
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