摘要
植物单宁是一类存在于植物体内的多元酚化合物，它是植物在进化过程中与环境相互作用而产生的自身保护物质，广泛存在于自然界的植物的各种组织中，除幼嫩的分生组织外，几乎所有植物组织都含有单宁，例如叶子、树皮和果实等。单宁是仅次于纤维素、半纤维素和木质素的第四大次级代谢产物。单宁的结构类型多样，可根据其结构特征和化学性质而分为 3 大类，即水解单宁(没食子单宁与鞣花单宁)、缩合单宁和复合单宁。单宁不仅味道苦涩，还可与蛋白质、生物碱、多糖等大分子物质形成不溶性复合物，显著降低了动物摄食率。单宁进入动物消化道内后与肠道黏膜的蛋白质或部分消化酶结合，影响细胞膜的通透性，从而减少动物肠道对营养物质的消化吸收，降低了动物对营养物质的消化率，因此被认为是一种抗营养因子。由于单宁的抗营养性给饲料等行业的发展带来了诸多困难，使许多富含蛋白质的饲料原材料(如菜粕、豆粕等)无法被有效利用而造成了大量营养成分的浪费。因此单宁的去除对于提高植物性饲料原材料中的蛋白质利用率具有极其重要的意义。微生物对单宁的生物解毒途径主要有两种：(1)微生物会向胞外分泌化合物，这些化合物与单宁具有高度亲和性，从而代替微生物重要酶类或蛋白质与单宁结合。(2) 微生物能够分泌可抵抗单宁毒性且能催化单宁发生降解的酶类。尽管很多学者已经研究出部分单宁的降解途径，但由于单宁分子的复杂性，这些降解机理并不能完全解释不同单宁的降解机理。本研究的目的是分离筛选出单宁降解菌株，优化菌株培养和发酵条件，解析单宁的降解代谢产物，以期为单宁的降解机理及饲料脱毒等提供理论依据。主要取得以下结果： 1) 单宁降解菌株的分离和鉴定 通过富集培养的方法，从湖南常德榨油工厂采集的土壤样品中分离筛选出一株能以单宁为唯一碳源生长的菌株 C12。通过 PCR 技术获得菌株的基因序列，通过对菌株16S rRNA的基因序列进行相似性比较分析，结合生理生化指标验证结果，发现降解菌株C12与Agrobacterium pusense LMG25623T的16S rRNA基因相似度最高（98.85%）。但进化树结果表明菌株C12与Rhizobium pongamiae VKLR-01T的同源性最高，且置信度为100%，因此将其命名为Rhizobium sp. C12。 2) 菌株C12降解单宁的特性及发酵条件优化 利用单因素优化法进一步优化了降解菌株 Rhizobium sp. C12 的生长条件，实验发现菌株C12最适培养条件是：温度为28℃、pH为5.0、接种量为3%、最优碳源为蔗糖，最优氮源为蛋白胨。最佳发酵条件是：温度为 30℃、接种量为3%、装液量为50mL、发酵时间为72h，在此条件下菌株Rhizobium sp. C12的降解率为71%。 3) 单宁代谢产物及代谢途径分析 本实验通过LC-MS分析方法鉴定出单宁的五种代谢产物，分别为：(1) 1,2,6-三-O-没食子酰-β-D-吡喃葡萄糖;(2) 1-没食子酸酰葡萄糖;(3) 葡萄糖;(4) 没食子酸;(5)焦棓酸。本实验还发现菌株C12会优先利用底物中的葡萄糖而非催化没食子酸形成焦棓酸，因此代谢产物中出现没食子酸（52.65%）与焦棓酸（41.19%）积累，而葡萄糖（0.15%）含量很低的情况。通过对代谢产物分析，对单宁代谢途径进行了预测。菌株 C12 通过不断催化单宁产生没食子酸与葡萄糖从而降解单宁，最终葡萄糖被作为碳源利用，没食子酸脱羧生成焦棓酸。
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