摘要
背景及目的：目前胃癌的治疗策略仍面临诸多挑战，寻找高效、低毒的新型抗胃癌治疗药物或分子迫在眉睫。天然药物及其衍生物来源广泛、结构多样，常常为新药的发现带来启发和灵感，一直以来是开发新药的重要来源。目前以它们为基础而研发的许多抗肿瘤药物，已使大多数临床患者获益。甘草西定是甘草的主要活性成分之一，具有广泛的药理学作用。近年来甘草西定显著的抗肿瘤作用已引发学者们的关注，但其是否也具有抗胃癌活性，尚无研究报道。本文拟通过体内外实验评价甘草西定的抗胃癌作用，并利用蛋白质组学技术及临床资料分析，初步阐明其作用机制，为今后将甘草西定开发为抗胃癌药物的候选分子奠定基础。 方法： 1、用不同浓度的甘草西定处理人胃癌细胞株 MGC-803 细胞和 HGC-27 细胞，另设 5-氟尿嘧啶（5-FU）阳性对照组。CCK-8 法测定甘草西定对胃癌细胞的半数抑制浓度（IC50），并计算不同时间点的抑制率。平板克隆实验及EdU实验观察细胞增殖。PI 染色后利用流式细胞术检测细胞周期；Annexin Ⅴ-FITC/PI双染及 Giemsa 染色评价细胞凋亡；迁移/侵袭实验及划痕实验观察细胞转移。Western Blot检测细胞周期相关蛋白（cyclin D1和CDK4）、凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax、Cyt-C、Caspase-3）及转移相关蛋白（MMP-2、MMP-9）的表达水平。构建MGC-803胃癌细胞的荷瘤裸鼠动物模型，隔日1次腹腔注射不同浓度的甘草西定（共 7 次），每 3 天记录裸鼠的体重及肿瘤生长情况，绘制生长曲线。Western Blot技术和免疫组织化学染色检测移植瘤的Ki-67、Bcl-2及Bax蛋白表达水平。苏木精-伊红染色（HE）评价甘草西定的体内毒性反应。 2、用甘草西定处理MGC-803细胞，空白组做对照。利用定量蛋白质组学的串联质谱标签（TMT）技术筛选差异表达的蛋白质，生物信息学分析并预测作用靶点，分子对接模型、Western Blot技术及免疫组织化学染色验证靶点。 3、挖掘TIMER和GEPIA数据库中靶点蛋白的相关数据；收集胃癌患者的临床资料和组织标本，利用 PCR 技术和免疫组织化学染色实验，分别比较胃癌及癌旁组织中靶点蛋白的表达差异；分析靶点蛋白与胃癌患者临床特征的相关性。 结果： 1、甘草西定对胃癌细胞株有显著的抑制作用，IC50分别是：7.558μM（HGC-27）和10.41μM（MGC-803）。与对照组相比，甘草西定以浓度依赖的方式发挥抗胃癌作用，即显著抑制胃癌细胞的增殖、克隆集落的形成及EdU阳性细胞数；阻滞MGC-803细胞的细胞周期于G0/G1期，并抑制cyclin D1和CDK4蛋白的表达；诱导胃癌细胞发生凋亡，并观察到凋亡细胞典型的形态学变化，下调 Bcl-2的同时促进了Bax、Cyt-C及Caspase-3等蛋白的表达；抑制胃癌细胞发生迁移、侵袭的能力，阻碍划痕愈合，下调MMP-2、MMP-9的水平。 2、甘草西定以浓度依赖的方式在体内发挥抗胃癌作用，即抑制裸鼠移植瘤的生长及Ki-67蛋白的表达，下调Bcl-2并上调Bax以诱导凋亡。HE染色未观察到各组荷瘤裸鼠的重要脏器发生病理改变。 3、经TMT技术鉴定出差异蛋白共19个，包括上调的蛋白质2个（ADAT2和PLA2G12A），下调的蛋白质17个（CRYL1、PRPSAP1、ACTR3B、DUSP11、LSM5、DNM1、CLIP2、EIF1、DOT1L、GTPBP3、DERL1、TBC1D23、NOS2、ICMT、DPM1、PRAF2、TRAPPC5）。差异蛋白分布于细胞质（39.13%）、细胞核（26.09%）、线粒体（13.04%）、细胞质膜（13.04%）、胞外（4.35%）和细胞骨架（4.35%）。异戊二烯羧基甲基转移酶（ICMT）是差异表达最显著的蛋白质之一（p＜0.001），差异表达倍数（FC）为0.734805226881093；差异蛋白在“异戊烯基半胱氨酸羧甲基转移酶家族”等结构域中显著富集；“蛋白C端S-异戊烯基半胱氨酸羧基O-甲基转移酶活性”的分子功能发生了显著变化；“萜类骨架生物合成”信号通路下调。由此推测ICMT可能是甘草西定抗胃癌活性的靶点蛋白。分子对接模型中甘草西定通过形成氢键与ICMT的酪氨酸（TYR）残基（TYR-131）结合，对接分数为-9.165。ICMT在胃癌细胞和移植瘤组织的表达水平随甘草西定干预浓度的增加而显著降低，其下游信号分子Ras-GTP、p-Raf和p-ERK也被有效抑制（p＜0.05）。 4、TIMER和GEPIA数据库均显示胃癌组织中ICMT的表达水平显著高于正常组织（p＜0.05）。60例胃癌患者癌组织中ICMT的mRNA相对表达量显著高于癌旁正常组织（p＜0.05）。ICMT 高表达者以贲门癌患者居多（63.16%）， Lauren 分型以混合型为主（80%）且分化程度低（57.45%），T3-T4 期占比高（63.64%），突变p53常见（68.42%），上述相关性均具有统计学意义（p＜0.05）。 结论：本研究初步证实了甘草西定具有显著的抗胃癌活性，其机制可能与下调ICMT/Ras信号通路有关，今后可作为新型抗胃癌药物的候选分子。
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