摘要
目的： 1.对一个血友病B(HB)家系进行遗传学诊断。 2. 研究新发现的错义突变c.1181T＞C(p.Met394Thr)分子发病机制。 方法： 1.凝血检测：对一个HB家系进行凝血检测，利用凝固法检测该家系成员的部分活化凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT),采用一期法检测该家系的凝血因子IX活性(FIX∶C)水平,利用酶联免疫吸附法检测凝血因子IX抗原(FIX∶Ag)含量。 2.基因突变分析：利用PCR扩增凝血因子IX基因(F9)的编码区及其侧翼序列，随后通过sanger测序技术检测F9的变异情况。 3.体外实验：为了探索新变异的分子发病机制，我们进行了体外实验。将含有野生型或突变型凝血因子IX(FIX)cDNA的质粒瞬时转染到HEK293T细胞中，随后利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测FIX基因(F9)mRNA表达水平;通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测FIX抗原(FIX∶Ag)含量;利用Western Blotting检测FIX蛋白含量。 4.生物信息学分析：利用polyphen2,SIFT和Mutation Taster多个在线工具预测新变异的致病性;通过Unipro UGENE软件对来自不同物种的同源序列进行比对,评估FIX蛋白不同位点氨基酸残基的保守性;使用Swiss-model在线工具对野生型FIX蛋白建模，并利用Pymol软件进行可视化分析。 结果： 1.凝血检测结果：凝血检查显示，HB先证者及其弟弟的APTT延长(43s和37.4s),PT正常(12.3s和11.2s),FIX∶C在先证者及其弟弟中分别为1.9％ 和2.9％。先证者外祖母的APTT轻度延长，FIX∶C为31.12％,先证者母亲的APTT正常，FIX∶C为50.2％。先证者父亲的凝血检测结果正常。 2.基因分析结果：我们发现了 HB家系中一个新的错义突变(c.1181T＞C,p.Met394Thr),先证者的母亲和外祖母为该变异的携带者。此外，其外祖母F9的内含子1有一个可能影响FIX蛋白功能的点突变(c.88+75A＞G)。 3.体外实验结果显示：我们将野生型FIX∶C和FIX∶Ag水平设定为100％时,突变型(FIX-Met394Thr)细胞培养基中FIX∶C为9.3％±4.4％;ELISA结果显示,突变型细胞培养基和裂解液中FIX∶Ag的水平分别为87％±18％和98％±3％;Western Blotting结果表明，在细胞内外的蛋白含量与野生型相比没有明显差异;经qRT-PCR检测，FIX-Met394Thr的mRNA表达水平为野生型的0.81±0.30。 4.生物信息学分析结果：使用polyphen2,SIFT和Mutation Taster预测p.Met394Thr变异是致病性的;保守性分析显示，FIX蛋白第394位的甲硫氨酸在多个物种中高度保守;模型分析显示，突变型的氨基酸残基结构及其周围氢键发生了明显改变，此外，p.Met394Thr变异在空间上接近由Cys382和Cys396形成的二硫键，该变异可能影响二硫键的形成。 结论： 1.本研究报道了一种F9新变异，丰富了F9突变数据库。 2.p.Met394Thr变异没有影响F9的转录、FIX蛋白的合成和分泌。该变异可能通过破坏FIX蛋白的空间构象导致HB。 3.本研究可能为今后HB的精准治疗提供新策略。
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