摘要
研究目的:膀胱癌是常见的泌尿系肿瘤之一，易进展、复发，早筛早诊是有效提升其治疗效果的重要方式。目前，膀胱镜是膀胱癌诊断的金标准及术后监测的主要方式，但是一种有创检查并易伴有尿路感染等并发症，而尿脱落细胞学、FISH等辅助诊断方式的敏感性与特异性有待进一步提升。因此，研发适用于膀胱癌早筛早诊的无创检测方式具有重要临床意义。肿瘤遗传突变特征谱揭示了TERT、ADGRG6等基因在膀胱癌中的高突变率，其中ADGRG6增强子的两个高频突变位点(chr.6:142,706,206 G＞A,chr.6:142,706,209 C＞T)发生频率高达约 50％。尿液是膀胱癌液体活检的理想媒介，具有生物信息丰富、易获取的特点。因此，开展基于尿液的ADGRG6增强子两个高频突变位点的检测体系研发与临床应用研究，有望为膀胱癌无创早筛提供新思路。 方法:本研究旨在建立基于扩增阻碍突变系统(ARMS)的qPCR检测方法，利用该方法通过尿液就能无创筛查膀胱癌相关ADGRG6高频突变位点。为了验证ARMS-qPCR检测体系的检测性能，构建了质粒参考标准品、细胞DNA参考标准品;为了探究ARMS-qPCR在膀胱癌早期筛查领域里的诊断性能，提取了30例膀胱癌患者的尿液上清游离DNA(cfDNA)及沉渣DNA(sDNA),分别进行ARMS-qPCR检测及Sanger测序，结果不一致的样本进一步通过微滴数字PCR(DD-PCR)验证，同时，我们利用ARMS-qPCR方法检测了100例正常人尿液样本及90例确诊为尿路感染或尿路结石而非肿瘤患者的尿液样本。 结果:建立的ARMS-qPCR检测体系在检测突变频率为1％的质粒参考标准品时,敏感度为100％,特异度为96.7％;在检测突变频率为0.5％的细胞DNA参考标准品时，敏感度为96.7％,特异度为100％。Sanger测序及ARMS-qPCR检测30例膀胱癌患者尿液的检测结果一致率达到93.3％,将以上两种检测结果不一致的尿液DNA样本进一步进行DD-PCR验证,显示ARMS-qPCR与DD-PCR检测结果吻合。在100例正常人尿液样本中，ARMS-qPCR检测出3例样本携带高频突变位点。在90例确诊尿路感染或尿路结石的非肿瘤患者尿液样本中，ARMS-qPCR并未检出样本携带突变。在临床样本的检测中，该ARMS-qPCR检测体系的敏感度为83.3％,特异度为98.4％。 结论:我们建立了一种新型的膀胱癌相关ADGRG6高频突变的尿液检测方法，具有较高的准确性和敏感性，有望为快速无创早期筛查膀胱癌和监测后续复发提供新策略。
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