摘要
目的： 通过建立抗生素相关性腹泻(antibiotic-associated diarrhea，AAD)小鼠模型，观察小鼠粪便的菌群比例、菌群代谢产物-短链脂肪酸（Short-Chain Fatty Acids，SCFAs）含量及小鼠肠道黏膜屏障的损伤情况；明确AAD发生与肠道黏膜固有免疫中三组先天淋巴细胞（Group 3 Innate lymphoid Cells，ILC3s）变化相关性；探究ILC3s所产生的IL-22介导肠道上皮细胞（Intestinal epithelial cells，IECs）发生AAD损伤后修复的机制。 方法： 1.建立抗生素相关腹泻模型，分为Nacl组（生理盐水灌胃对照组）、AAD组（抗生素持续给药组）、AAD+IL-22组（抗生素+IL-22给药组），监测各组小鼠体重变化、腹泻率、粪便含水量及死亡率。 2.收集AAD发生前后小鼠粪便标本,通过高通量测序检测肠道菌群丰度变化，气相色谱质谱仪检测短链脂肪酸的含量变化。 3.处死小鼠取新鲜结肠组织制备单细胞悬液，应用流式细胞术定量检测ILC3s。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测结肠组织IL-22含量。 4.处死小鼠取结肠组织进行HE染色、免疫组织化学染色，镜下观察结肠组织形态、AQP8和 Claudin-1等肠道损伤标志物的阳性表达水平。 5.处死小鼠取结肠组织进行实时荧光定量PCR（RT-qPCR）及Western-blot检测肠道损伤相关因子AQP8和 Claudin-1、短链脂肪酸下游基因GPR41mRNA、HIF1αmRNA及肠道上皮细胞修复相关STAT3信号通路磷酸化水平。 结果： 一、抗生素持续给药组（AAD组）小鼠发生AAD后的变化： 1.抗生素持续给药组（AAD组）小鼠相比于生理盐水组（Nacl组）整体状态差，体重明显减轻，腹泻率及死亡率均增高，小鼠粪便含水量增多，肠道菌群丰富下降，菌群代谢产物-短链脂肪酸含量减少。差异均有统计学意义（P＜0.05）。 2.取新鲜小鼠结肠标本制备单细胞悬液，应用流式细胞学方法检测ILC3s变化结果发现：AAD组小鼠ILC3s 占全部淋巴细胞百分比低于Nacl组，差异有统计学意义（P＜0.05）；应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测新鲜结肠组织中IL-22含量发现：AAD组小鼠肠道IL-22水平低于Nacl组，差异有统计学意义（P＜0.05）。 3.处死小鼠取结肠组织发现：AAD组小鼠肠管较Nacl组色泽暗淡，管壁弹性差。进行HE染色后镜下观察，AAD组肠黏膜损伤，Nacl组肠道结构完整。 4.处死小鼠取结肠组织，应用免疫组织化学染色、PCR、Western-blot方法检测肠道损伤相关因子AQP8和 Claudin-1的mRNA和蛋白表达量：AAD组小鼠肠道Claudin-1、AQP8表达均低于Nacl组；短链脂肪酸下游基因GPR41、HIF1αmRNA表达量AAD组较Nacl组低。以上差异均有统计学意义（P＜0.05）。 二、抗生素+IL-22给药组（AAD+IL-22组）小鼠发生AAD后的变化： 1.AAD+IL-22组小鼠一般状态较好，体重轻度下降，腹泻率及死亡率均低于AAD组，以上差异均有统计学意义（P＜0.05）。 2.处死小鼠取结肠组织发现：AAD+IL-22组结肠肠管色泽较暗淡，管壁弹性仍差。HE染色后镜下观察发现：AAD+IL-22组小鼠肠道黏膜损伤程度较AAD组好转。 3.处死小鼠取结肠组织，应用免疫组织化学染色、RT-qPCR、Western-blot方法检测肠道损伤相关因子AQP8和 Claudin-1的mRNA和蛋白表达量：AAD+IL-22组小鼠肠道Claudin-1、AQP8mRNA、蛋白表达较AAD组升高；应用Western-blot方法检测肠道上皮细胞修复相关STAT3信号通路磷酸化情况发现：AAD+IL-22组小鼠肠道phosphoSTAT3/STAT3（STAT3磷酸化）蛋白表达高于AAD组,（P＜0.05）。以上差异均有统计学意义（P＜0.05）。 结论： 1.AAD发生时小鼠肠道菌群菌群丰度及SCFA含量明显下降、肠道黏膜损伤，肠道Claudin-1、AQP8表达受损。 2.AAD发生时小鼠肠道菌群代谢产物SCFA下游通路HIF1-α、GPR41表达下降。 3.AAD发生影响小鼠肠道固有免疫，ILC3s数量下降,并且其肠道组织中IL-22含量也明显下降。 4.外源性给予IL-22抵抗AAD发生所引起的肠道黏膜损伤，使肠道Claudin-1、AQP8表达上调，可能通过STAT3磷酸化机制进行修复。
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