摘要
自然放牧绵羊在青草期和枯草期受到剧烈环境变化的影响，会通过调控脂质代谢来调节产热和供能，进而维持一定的生理状态来应对环境变化。本研究旨在探究自然放牧绵羊是否通过白色脂肪组织棕色化来应对环境变化，以及自噬在其中发挥的作用，并进一步通过体外试验，研究冷刺激诱导绵羊白色脂肪细胞棕色化过程中，mTOR介导的自噬如何调控绵羊白色脂肪细胞棕色化。 体内试验:以自然放牧苏尼特羊为研究对象，分别采集皮下脂肪和尾部脂肪。采用qRT-PCR方法检测棕色化标记基因和自噬标志基因的mRNA表达量。体外实验:分离绵羊前体脂肪细胞，诱导细胞成脂分化，使用β-肾上腺素能激动剂FSK诱导其棕色化，建立冷刺激下的绵羊白色脂肪棕色化细胞模型，通过油红O染色观察细胞中脂滴变化，使用qRT-PCR和Western Blotting检测细胞中棕色化标记基因在mRNA和蛋白水平上的变化;qRT-PCR方法检测线粒体的生物合成基因以及脂肪酸β-氧化标志基因表达量在棕色化过程中的变化，并对线粒体活性和数量进行检测;用qRT-PCR和Western Blotting检测细胞中自噬标记基因在mRNA和蛋白水平上的变化，并检测自噬小体的数量;激活和抑制mTOR信号通路，检测激活和抑制效率，使用油红O 染色和免疫荧光法检测细胞内脂滴、自噬小体和线粒体数量，用qRT-PCR和Western Blotting检测细胞中自噬、棕色化、线粒体合成和脂肪酸β-氧化的标记基因在mRNA和蛋白水平上的变化。 试验结果如下: 1.在绵羊皮下脂肪中，UCP1、CIDEA和PRDM16这3个棕色化标志基因的表达量在枯草期显著升高（P＜0.05）;而PGC-1α的表达量在枯草期极显著升高（P＜0.001）。在尾部脂肪中PGC-1α的表达量在枯草期显著升高（P＜0.05）,而其他3个基因的表达量在枯草期极显著升高（P＜0.001）。与青草期相比，自噬标志基因的mRNA水平在枯草期均下调（P＜0.05）;自噬底物P62基因在枯草期时表达量显著升高（P＜0.05）。结果表明，在枯草期绵羊脂肪组织发生棕色化，同时细胞自噬作用减弱。 2.使用FSK模拟冷刺激，处理绵羊脂肪细胞后，脂滴变得小而密集，脂质合成标志基因的mRNA表达量均显著下降（P＜0.01）;棕色化标志基因的mRNA表达量均显著上调（P＜0.05）,蛋白水平也显著上升（P＜0.05）。结果表明，在体外成功建立了冷刺激下绵羊白色脂肪棕色化的细胞模型。 3.绵羊白色脂肪细胞棕色化过程中，线粒体数量显著增加（P＜0.01）,线粒体合成标志基因的mRNA的表达量显著升高（P＜0.05）,线粒体脂肪酸β-氧化基因的表达量同样显著升高（P＜0.01）;同时，自噬小体数量减少，自噬标志基因的表达均显著降低（P＜0.05）,自噬底物P62的表达趋势极显著上升（P＜0.001）,蛋白水平与mRNA趋势一致（P＜0.05）。结果表明，体外试验中随着绵羊脂肪细胞棕色化，线粒体活性增加,自噬过程受到抑制。 4.激活mTOR信号通路，绵羊脂肪细胞自噬小体数量下降，自噬标志基因的表达均显著降低（P＜0.05）,自噬底物P62的表达趋势极显著上升（P＜0.001）,蛋白水平与mRNA趋势一致（P＜0.05）;细胞内脂滴数量增多，棕色化标志基因的mRNA（P＜0.01）和蛋白（P＜0.05）表达量显著上升;线粒体数量增多，线粒体合成标志基因的mRNA的表达量显著上升（P＜0.05）,线粒体脂肪酸β-氧化基因的表达量同样显著上升（P＜0.01）。抑制mTOR信号通路，则与上述趋势相反。结果表明，mTOR介导自噬调控冷刺激诱导的绵羊白色脂肪细胞棕色化。 本研究探究了自然放牧绵羊的皮下脂肪和尾部脂肪在枯草期发生了白色脂肪组织棕色化，并且自噬过程受到抑制。使用FSK模拟冷刺激诱导绵羊白色脂肪细胞棕色化,可以在体外成功建立绵羊白色脂肪棕色化的细胞模型。在体外建立的细胞模型中，绵羊白色脂肪细胞棕色化过程中，线粒体活性增加，自噬过程受到抑制，而mTOR可以通过抑制自噬来促进绵羊白色脂肪细胞棕色化。
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