摘要
铅（Lead,Pb）是一种广泛存在的重金属污染物，可通过食物链在人和动物体内蓄积并产生毒性。硒是人和动物体内必不可少的微量元素，大量研究证实硒对重金属毒性具有颉顽作用。本试验以小鼠睾丸间质细胞为研究对象，探究硒对铅致睾丸间质细胞氧化应激、自噬及凋亡的影响，验证铅诱导细胞自噬的分子机制，为重金属胁迫造成机体损伤的防护提供实验依据。 将小鼠睾丸间质细胞分为对照组、Se组、Pb组和Se+Pb组，Se组在细胞培养液中添加2 μmol/L亚硒酸钠，Pb组添加40 μmol/L醋酸铅，Se+Pb组中2 μmol/L亚硒酸钠和40μmol/L醋酸铅联合处理，探究硒和铅对细胞氧化应激、自噬和凋亡的影响。在此基础上添加AMPK抑制剂Compound C,验证硒颉颃铅毒性的分子机制。采用MTT法测定细胞增殖活力;通过生化分析法检测细胞内GSH-Px、SOD的活性及MDA的含量，使用化学荧光法测定ROS水平;通过qRT-PCR和Western blot分别检测自噬相关基因（AMPK、ULK1、mTOR、Atg5、LC3和p62）、Nrf2 通路及下游基因（Nrf2、Keap1、HO-1和NQO1）和凋亡相关基因（Caspase3、Caspase8、Bax和Bcl-2）的mRNA和蛋白表达情况。试验结果如下: （1）与对照组相比，Pb组细胞增殖显著受到抑制（P＜0.05）;MDA和ROS水平显著上升，GSH-Px和SOD的活性显著下降（P＜0.05）;同时，铅显著上调了Nrf2、HO-1、NQO1、Caspase3、Caspase8、Bax的mRNA和蛋白表达水平，下调了Keap1、Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平（P＜0.05）。Se组小鼠睾丸间质细胞增殖活性较对照组显著提高（P＜0.05）。与Pb组相比，Se+Pb组细胞中MDA和ROS水平显著下降，SOD和GSH-Px活性显著升高，且介于对照组和Pb组之间（P＜0.05）;Nrf2、HO-1、NQO1、Caspase3、Caspase8、Bax的mRNA和蛋白表达水平显著下降，Keap1、Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平显著上升，介于Pb组和对照组之间（P＜0.05）。 （2）与对照组相比，Pb组细胞中AMPK、ULK1、Atg5、LC3的mRNA和蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）;与Pb组相比，Se+Pb组细胞中这四个基因表达水平均显著下降，但高于对照组（P＜0.05）。与对照组相比，mTOR和p62在Pb组的表达量显著降低(P＜0.05),Se+Pb组的表达量显著高于Pb组而低于对照组和Se组(P＜0.05)。 (3)添加AMPK抑制剂Compound C可显著下调细胞内AMPK、ULK1、Atg5、LC3、Keap1和Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平(P＜0.05),同时显著上调mTOR、p62、Nrf2、HO-1、NQO1、Caspase3、Caspase8、Bax的mRNA和蛋白表达水平(P＜0.05)。 研究表明，铅能抑制小鼠睾丸间质细胞增殖活力，诱导细胞氧化应激、自噬和凋亡，同时激活Nrf2信号通路抵御氧化应激损伤。补充适量硒可以促进细胞增殖，且通过提高抗氧化酶活性、激活Nrf2信号通路来缓解铅造成的细胞氧化应激和自噬，从而抑制细胞凋亡。添加AMPK抑制剂Compound C后，细胞自噬被抑制，过度激活Nrf2信号通路，促进细胞凋亡。
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