摘要
目的: 银屑病是一种常见的慢性复发性疾病，角质形成细胞的过度增殖和炎症反应是该病发生发展的主要病理生理学表现之一。本研究在对公共数据库进行Spred1分析的基础上，对银屑病患者皮损和健康人表皮中Spred1的表达情况进行检测，以明确Spred1在银屑病皮损中的表达。随后利用慢病毒感染技术构建Spred1高/低表达水平的HaCaT细胞株，检测Spred1不同表达水平下细胞的增殖、周期和炎症反应。该课题的研究旨在明确Spred1对角质形成细胞增殖和炎症反应的影响，初步探讨Spred1在银屑病发病中的作用，为银屑病发病机理的研究提供新的理论依据。 方法: 1.在线检索GEO数据库，筛选包括银屑病患者皮损和健康人表皮的数据集，分析两组数据中的差异性基因，提取Spred1不同分子探针下mRNA的表达值，进行整合，对银屑病患者皮损和健康人表皮中Spred1 mRNA的表达水平进行统计学分析。 2.通过RT-qPCR、WB测定6例临床银屑病患者皮损和6例健康人表皮中Spred1 mRNA和蛋白质水平。 3.经293T细胞包装Spred1高表达及其对照、Spred1低表达及其对照四种质粒的病毒液后，感染HaCaT细胞。通过荧光效率、RT-qPCR和WB法验证感染效率,建立Spred1高/低水平的稳转细胞株。 4.RT-qPCR检测Spred1表达升高/降低后HaCaT细胞中K16、PCNA、Ki67、CyclinD1和CDK2mRNA的表达变化;利用细胞克隆、CCK8、EdU、流式细胞技术检测Spred1表达升高/降低后HaCaT细胞增殖和周期变化。 5.RT-qPCR检测Spred1表达升高/降低后HaCaT细胞中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17A、IL-23和TNF-αmRNA的表达变化;ELISA法检测Spred1不同表达水平HaCaT细胞分泌炎症因子的变化。 结果: 1.通过对GEO数据库进行检索，得到GSE14905数据集。提取Spred1表达值，结果显示与健康人表皮相比较，银屑病患者皮损中Spred1 mRNA水平降低。随后，临床样本结果再次显示，与健康人表皮相比，银屑病患者皮损Spred1 mRNA和蛋白质表达降低。 2.利用293T细胞包被病毒液，感染HaCaT细胞后，细胞绿色荧光效率均大于80％。且HaCaT细胞中高表达-Spred1组Spred1 mRNA和蛋白质均高于其对照的2倍以上，而低表达-Spred1组中Spred1 mRNA和蛋白质均能敲低40％以上。 3.Spred1低表达后HaCaT细胞K16、PCNA和Ki67 mRNA表达水平均增高且均具有统计学意义。细胞克隆、CCK8、EdU实验结果显示，Spred1低表达后HaCaT细胞克隆数增多、细胞生长速度提高、细胞增殖加快。 4.Spred1低表达后HaCaT细胞CDK2和Cyclin D1 mRNA表达水平均增高且均具有统计学意义。流式细胞技术检测不同Spred1水平下HaCaT细胞周期情况，结果显示Spred1低表达后HaCaT细胞S期细胞数增多且具有统计学意义。 5.Spred1 低表达后 HaCaT 细胞中 IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17A 和 TNF-αmRNA 的表达水平均升高且均具有统计学意义，IL-23 mRNA表达水平升高，但不具有统计学意义。通过ELISA法测定Spred1表达升高/降低后HaCaT细胞分泌炎症因子的变化，结果显示 Spred1 低表达后 HaCaT 细胞分泌 IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17A、IL-23 和 TNF-α因子水平均升高，除了 IL-23外其余因子的差异均具有统计学意义。 结论: 1.与健康人表皮相比，银屑病患者皮损中Spred1 mRNA和蛋白质表达降低。 2.Spred1低水平能加快HaCaT细胞生长，还能提高HaCaT细胞S期的细胞数量，起到促进HaCaT细胞增殖的作用，从而参与银屑病中角质形成细胞过度增殖的病理过程。 3.Spred1低水平能促进HaCaT细胞分泌炎症因子，增强角质形成细胞炎症反应,进而参与银屑病皮损局部复杂的炎症因子网络。
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