摘要
目的: 酒精性肝病(Alcohol liver disease,ALD)是世界范围内的健康威胁，缺乏特效疗法。肠道菌群失调及伴随的肠道通透性增加与ALD的发生发展密切相关。益生菌对ALD的保护作用研究有限，机制不明。更有效的肠道微生态调节剂及其相关机制尚需深入探索。本研究皆在探索一种复合益生菌对急性ALD小鼠的保护作用及其机制,为开发新的ALD治疗方案提供线索。 方法: 复合益生菌缓解ALD实验:将6-8周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为正常对照组(Control group,记为 Ctrl group)、乙醇模型组(Ethanol group,记为 Eth group)、复合益生菌治疗组(Probiotics group,记为Pro group)和水飞蓟素治疗阳性对照组(Silymarin group,记为 Sily group),每组 10 只小鼠。Pro group 每日一次灌饲 7.5×109 CFU的复合益生菌，Sily group每日一次灌饲200 mg/kg的水飞蓟素，其余组每日灌饲等量PBS,连续5天。在最后一次灌饲后，禁食6小时建立急性酒精肝模型，即50％乙醇以 10mL/kg 的剂量灌胃 Eth group、Pro group 及 Sily group,1 小时后以 5mL/kg的剂量再次灌胃，同时，Ctrl group灌胃等能量的麦芽糖。16小时后处死各组小鼠，记录体重、肝重，并收集血清、肝组织、回肠组织和盲肠内容物进行以下检测。 检测血清甘油三酯(Triglyceride,TG)、天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate transaminase,AST)及丙氨酸氨基转移酶(Alanine transaminase,ALT)。对肝组织，HE染色观察病理改变、油红O染色观察脂肪变性，免疫组化及RT-PCR检测炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6,免疫荧光检测巨噬细胞标记分子F4/80,利用商业试剂盒检测氧化应激指标丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD),ELISA 检测内毒素(Lipopolysaccharide,LPS),Western blotting 检测 TLR4/NF-κB 炎症通路蛋白的表达,RT-PCR检测脂肪酸代谢相关基因FAS、PPARα、PPARγ和CPT-1的表达,Western blotting检测AMPK-PPARα信号通路蛋白的表达。对回肠组织，HE染色观察病理改变、阿利新蓝染色分析黏液层分泌情况，免疫荧光及RT-PCR检测紧密连接(Tight junction,TJ)蛋白ZO-1、Occludin的表达。对盲肠内容物进行16SrRNA高通量测序，分析肠道菌群丰度及组成。 粪菌移植实验:6-8周龄雄性C57BL/6小鼠自由饮用含广谱抗生素的无菌水5天后随机分为2组，记为Con-Eth group和Pro-Eth group,每组6只小鼠。Con-Eth group灌饲 Ctrl group 的粪菌;Pro-Eth group 灌饲 Pro group 的粪菌。粪菌移植(Fecal bacteria transplantation,FMT)7天后，各组小鼠建立急性酒精肝模型，16小时后结束小鼠实验，采集组织标本同前。检测血清ALT、AST;肝组织进行HE和油红O染色;回肠组织进行HE染色、阿利新蓝染色和免疫荧光检测TJ蛋白表达。 结果: 1.Ctrl group小鼠肝脏外观光滑、红润柔软，而Eth group小鼠肝脏呈黄白色、有颗粒感，Pro group及Sily group肝脏类似Ctrl group。肝组织HE染色结果观察到Eth group肝小叶结构紊乱，有弥漫性的细胞水肿及脂肪变性，Pro group及Sily group这些病理改变得到显著改善，类似Ctrl group。相比于Ctrlgroup,Ethgroup肝指数明显降低。酒精摄入后血清ALT、AST明显升高，而Pro group及Sily group血清ALT、AST显著降低。 2.与 Ctrl group 相比，Ethgroup 炎性因子(TNF-α、IL-1β 和 IL-6)表达、F4/80+巨噬细胞浸润明显增加，益生菌治疗后明显降低。相比于Ctrl group,Eth group小鼠肝脏中LPS浓度、TLR4蛋白表达和p-NF-κB/NF-κB比值显著增加，IκB蛋白表达降低，而Progroup肝脏LPS浓度、TLR4蛋白表达和p-NF-κB/NF-κB比值均降低，IκB蛋白表达升高。与Ctrl group相比，Eth group小鼠肝组织抗氧化指标GSH、SOD明显降低，而氧化终产物MDA明显升高，益生菌治疗后，肝脏氧化应激明显改善。Sily group 结果类似 Pro group。 3.Eth group小鼠肝脏油红O阳性区域、血清TG明显高于Ctrl group,而Pro group和Sily group与Ctrl group相近。Eth group小鼠肝脏中脂肪酸合成相关基因(FAS和PPARγ)表达升高，而脂肪酸分解相关基因(CPT-1 and PPARα)降低;益生菌和水飞蓟素治疗后，以上情况有所改善。Eth group小鼠肝脏组织AMPK、p-AMPK和PPARα表达明显低于Ctrl group,益生菌和水飞蓟素治疗后这些蛋白的表达均增加。 4.小鼠盲肠内容物16SrRNA基因测序结果显示，Sobs、Shannon和Chao指数为代表的α多样性在四个组无统计学意义。但β多样性结果显示出四个明显不同的聚集，表明肠菌分布差异显著。维恩(Venn)图结果表明，总丰富度524个操作分类单元(Operational taxonomic units,OTUs)中有 260 个 OTUs 是四个组共有的，359 个OTUs、420 个 OTUs、392 个 OTUs、437 个 OTUs 分别是 Ctrl group、Eth group、Pro group、Silygroup特有的;在门水平上，酒精摄入降低了厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacterota)的相对丰度，而升高了拟杆菌门(Bacteroidota)和变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度。益生菌和水飞蓟素治疗后厚壁菌门的相对丰度升高，而拟杆菌门和变形菌门的相对丰度降低，益生菌治疗也升高了放线菌门和疣微菌门(Verrucomicrobiota),降低了脱硫菌门(Desulfobacterota)的丰度;在科和属水平上，益生菌和水飞蓟素均能在一定程度上改变肠道菌群的组成。采用线性判别分析效应量法(Linear discriminant analysis effect-size method,LEfSe)分析各组优势菌群，发现四个组的优势菌群存在显著差异。 5.回肠HE染色结果观察到Eth group回肠结构松散，排列无序，而Ctrl group和Pro group 回肠绒毛整齐且致密。相比于 Eth group 和 Sily group,Ctrl group 和 Pro group的绒毛更长。Pro group粘蛋白、Occludin和ZO-1的表达明显高于Eth group,也高于Sily group。 6.相关性分析结果显示，Lachnospiraceae、Lactobacillaceae、norank_o_Clostridia_UCG-014、Eggerthellaceae和 Erysipelatoclostridiaceae 与肝指数、抗氧化指标、TJ蛋白表达和脂肪酸代谢mRNA表达呈显著正相关，与血液参数、氧化指数、炎症因子和LPS-TLR4/NF-κB通路呈负相关。然而，Enterobacteriaceae、Enterococcaceae、Tannerallaceae、Akkermansiaceae 和Eubacterium_coprostanoligenes_group与以上指标呈现相反相关性。 7.为了证实复合益生菌是否通过调节肠道菌群来改善急性酒精性肝损伤，我们进行了粪菌移植实验。结果显示，与Con-Eth group相比，Pro-Eth group小鼠肝脏结构紊乱和脂肪变性明显好转，肝指数明显升高，血清ALT、AST降低;此外，相比于Con-Eth group,Pro-Eth group回肠绒毛排列整齐，粘蛋白、绒毛长度和TJ蛋白表达均增加。 结论: 1.复合益生菌可拮抗急性酒精摄入导致的肠道菌群紊乱，维持肠道屏障的完整性，降低LPS肝转移，通过抑制TLR4/NF-κB炎症信号通路缓解肝脏炎症，并降低肝脏氧化应激。此外，复合益生菌通过调节脂肪酸代谢相关基因和AMPK-PPARα信号通路降低了肝脏脂肪变性。 2.复合益生菌对急性ALD的保护效果与水飞蓟素相似，但在调节肠道菌群和改善肠道屏障方面优于水飞蓟素，研究提示此复合益生菌可望用于临床成为改善ALD的辅助疗法或膳食调节剂。
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