摘要
背景: 冠状动脉疾病、缺血性心肌损害、心肌炎和心肌病等心血管疾病的患病率和死亡率逐年持续增高。心血管疾病发生时会阻碍流向心肌的血液流动，导致心肌缺血或心肌梗死(myocardial infarction,MI),然后发展为心力衰竭。然而，现在已有的治疗策略并不能很好地缓解心梗后心衰的进展。成年哺乳动物心脏在损伤后无法再生是心血管医学的主要障碍，究其原因是成年哺乳动物心脏损伤后的心肌细胞不可再生和血管再生不足，导致受损心脏的收缩功能持续恶化。在缺乏有意义的再生能力情况下，成年哺乳动物心脏经历一系列病理重塑事件，包括纤维化瘢痕组织替换坏死心肌组织、存活心肌病理性肥大，最终导致心脏收缩功能障碍。然而，与成年鼠不同的是，新生乳鼠在心脏受损后有限的时间内能够完全得到再生，新生乳鼠模型是研究哺乳动物心脏再生和理解内皮细胞增殖能力分子机制的有力工具。 19号染色体上的一个开放阅读框(C19orf10)编码的一种蛋白质被命名为髓源生长因子(Myeloid-derived growth factor,Mydgf),一种由骨髓来源的单核-巨噬细胞产生的旁分泌蛋白，其在心梗后有较高的表达，能够促进血管内皮细胞的增殖，抑制心肌细胞的凋亡，对心梗后的心脏进行保护和修复。本课题组前期研究表明，Mydgf能够提高心肌细胞的增殖能力，并能促进心肌的再生。但是Mydgf作为一种生长因子是否能参与调控新生乳鼠心肌梗死后的血管新生尚不清楚。基于此，我们以新生乳鼠心肌梗死为模型，探究血管新生和Mydgf有无关系，Mydgf能否通过血管新生在心肌再生过程中起作用，对血管新生和心肌再生具体机制的调控进行阐述。 目的: 对Mydgf是否可以加速心脏的血管生成进行探究,以及Mydgf如何加速心脏的血管生成及心脏修复的具体机制进行阐述。 方法: 1.给予人脐静脉内皮细胞Mydgf重组蛋白，常氧或缺氧情况下处理后，利用免疫荧光染色检测内皮细胞增殖情况;人冠状动脉内皮细胞也给予Mydgf重组蛋白处理，利用IncuCyte实时动态细胞成像分析系统观察成管内皮细胞成管、迁移情况; 2.出生后不同时间段的小鼠心肌组织通过qRT-PCR和Western blot方法检测Mydgf、VEGF的表达量;1日龄乳鼠心肌梗死手术后1、4、7天检测结扎线以下心脏组织中Mydgf表达; 3.构建Mydgf-KO小鼠后，利用qRT-PCR和Western blot实验检测其敲除效率。对新生1日龄实施心肌梗死手术操作，通过Masson染色和心脏超声检测术后21天心肌纤维化程度和心功能变化; 4.新生1日龄野生型和Mydgf敲除乳鼠实施心肌梗死手术操作，在4天后,用免疫荧光方法对内皮细胞的增生和血管新生进行检测; 5.新生1日龄野生型和Mydgf敲除乳鼠实施心肌梗死手术操作，在4天后,通过蛋白质谱分析，验证Mydgf对心肌梗死的保护作用的可能机制; 6.设计Mydgf、Ctnnb1、VEGF小干扰RNA,处理人脐静脉内皮细胞检测细胞周期相关因子表达及内皮细胞增殖情况，处理人冠状动脉内皮细胞后检测血管新生情况。 结果: 1.Mydgf在胚胎期表达较高，出生后第4天略微增加，然后随着年龄的增长而逐渐减少;新生乳鼠心肌梗死损伤后Mydgf被诱导显著上调。表明Mydgf参与新生小鼠心肌梗死后修复。 2.Mydgf-KO小鼠心肌梗死术后未能彻底恢复，心功能降低，左室扩张，心脏纤维化面积较高，表明缺失Mydgf导致新生小鼠心脏再生能力下降。 3.生理情况下和心梗情况下Mydgf-KO小鼠免疫荧光染色显示CD31、Ki67+CD31显著下降，表明Mydgf敲除抑制新生小鼠内皮细胞增殖和血管新生。 4.Mydgf重组蛋白促进人脐静脉内皮细胞增殖，促进人冠状动脉内皮细胞迁移和血管形成改善内皮细胞的功能;Mydgf敲低抑制人脐静脉内皮细胞增殖和人冠状动脉内皮细胞血管形成。 5.VEGF随年龄的增长表达逐渐升高，提示VEGF的表达增加可能与补充Mydgf的下降维持身体内的血管有关;新生小鼠心脏损伤后被诱导显著上调。 6.生理情况下和心梗情况下Mydgf-KO抑制VEGF生成，表明VEGF参与Mydgf所致的内皮细胞增殖和血管生成。 7.通过蛋白质谱分析，发现Mydgf-KO后有统计学差异的为198个基因，显著上调的有21个基因，显著下调的有17个基因。Mydgf激活内皮细胞中的Fga、Fgb、Fgg、FGF1,Western blot证明Mydgf-KO后FGF1显著降低，表明Mydgf可能通过FGF1抑制血管生成。 8.Mydgf敲除后p-β-catenin表达下降,表明Mydgf激活Wnt/β-Catenin途径,介导Wnt/β-Catenin信号途径调节内皮细胞增殖和血管新生。 结论: 1.Mydgf可以介导内皮细胞的增生和血管新生进一步促进1日龄乳鼠心脏再生，Mydgf基因完全敲除后减弱内皮细胞增殖和血管新生从而阻碍1日龄乳鼠心脏进行再生，1日龄乳鼠心肌梗死后的修复进程大幅度减缓; 2.Wnt/β-Catenin或VEGF或FGF1因子介导Mydgf调控内皮细胞的增生和血管新生; 3.Mydgf基因敲除能够阻碍新生心梗小鼠的心肌再生和修复，提示Mydgf将有望成为一个新的治疗靶点，从而改善损伤心脏的功能。
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