摘要
目的:通过制备三重脑震荡大鼠模型和神经炎症及神经元铁死亡细胞模型，明确脑震宁可以通过影响丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路改善海马神经元铁死亡。 方法:通过在体动物实验和体外细胞实验进行课题研究。动物实验采用砝码自由落体法每间隔24 h撞击大鼠额颞叶部，连续撞击3 d以制备三重脑震荡大鼠模型。实验一分为12h组、24h组、48h组、72h组、7 d组、14d组和正常对照组;实验二分为模型组、吡拉西坦组、脑震宁低剂量组(N低)、脑震宁中剂量组(N中)、脑震宁高剂量组(N高)和正常对照组。采用平衡木实验检测大鼠运动协调能力;酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)检测白介素-1β(interleukin,IL-1β)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、白介素-10(interleukin-10,IL-10)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)等含量;硫代巴比妥酸(TBA)法检测丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量;水溶性四唑盐-1(WST-1)法检测超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性;苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠海马CA1区神经元的病理变化;尼氏染色观察大鼠海马CA1区神经元尼氏体及神经元数量的变化;反转录·聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)法和蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测谷胱甘肽过氧化物酶 4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、铁蛋白重链(ferritin heavy,FTH)和铁蛋白轻链(ferritin light,FTL)、丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38)、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)和 c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)mRNA表达和蛋白含量;普鲁士蓝染色观察大鼠脑组织内铁沉积情况;透射电子显微镜法观察大鼠海马神经元、线粒体及轴索超微结构的变化。 体外细胞实验研究中，分别采用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和Erastin诱导BV-2细胞神经炎症模型和HT22细胞铁死亡模型。将细胞分为模型组、吡拉西坦组（或Fer-1组）、N低组、N中组、N高组、JNK+N低组、JNK+N中组、JNK+N高组和正常对照组。ELISA法检测IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β1 等含量;TBA 法检测 MDA 含量;WST-1法检测SOD活性;DCFH-DA荧光探针法检测活性氧（reactive oxygen species,ROS）平均荧光强度;比色法检测铁离子含量，RT-PCR法和Western blot法检测GPX4、FTH、FTL、JNKmRNA表达和蛋白含量。采用SPSS24.0统计软件进行数据统计分析，使用单因素方差分析进行多组间比较，多重两两比较采用LSD检验。 结果:动物实验中不同时间点模型大鼠通过平衡木时间、运动协调能力评分以及IL-1β、IL-6、NSE含量与对照组相比均明显升高，GSH含量降低（P＜0.05）,尤其以48h组最明显;给予脑震宁药物治疗后，N低、N中、N高组大鼠通过平衡木时间、运动协调能力评分以及IL-1β、TNF-a、IL-6、IL-10、MDA含量与模型组相比出现不同程度降低，SOD活性升高（P＜0.05）,尤其以N高组效果最明显。在RT-PCR和Western blot检测指标中，不同时间点模型大鼠GPX4、FTL蛋白含量及mRNA表达与对照组相比出现明显升高，FTH蛋白含量及mRNA表达降低（P＜0.05）,尤其以12h、24h、48h组最明显;给予脑震宁药物治疗后，N低、N中、N高组GPX4、FTL、p38、JNK、ERK蛋白含量及mRNA表达与模型组相比出现不同程度降低，FTH蛋白含量及mRNA表达升高（P＜0.05）。HE和尼氏体染色结果显示不同时间点模型大鼠海马神经元出现排列稀疏，尼氏体颜色变浅，神经元数量明显减少（P＜0.05）;给予脑震宁治疗后，各组海马神经元排列较模型组紧密，细胞核居中或偏移，尼氏体颜色变深，神经元数量较模型组明显增加（P＜0.05）。透射电镜结果显示，不同时间点模型大鼠海马神经元细胞缩小，核仁破裂，核膜出现不同程度的皱缩，线粒体肿胀变形且有空泡存在，线粒体内嵴结构明显减少或消失;给予脑震宁治疗后，各组神经元细胞交模型组核大而圆，细胞核膜稍完整,核仁破裂，线粒体细长，空泡化减轻，内嵴结构完整清晰可见，轴索髓鞘板层排列模糊，板层崩解、断裂部分减少，轴浆内神经微丝及微管排列逐渐紧密，线粒体内嵴可见，空泡化减轻。 细胞实验一中BV-2细胞神经炎症在形态上表现为细胞胞体增生变大，两侧突起直径明显变粗且部分细胞突起变形;给予脑震宁作用后，细胞形态逐渐恢复圆形或椭圆形，两侧突起减少或变短。N低、N中、N高、JNK+N 低、JNK+N 中、JNK+N 高组 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、TGF-β1含量以及p-JNK、JNK蛋白含量和mRNA表达与模型组相比明显降低(P＜0.05),尤其是N中组最明显。实验二中与对照组相比，模型组MDA、Fe2+含量、ROS平均荧光强度以及GPX4、FTH、FTL、JNK蛋白含量和mRNA表达与对照组相比均明显升高，SOD活性降低(P＜0.05);给予脑震宁作用后，JNK+N低、JNK+N中、JNK+N高组MDA、Fe2+含量、ROS平均荧光强度以及GPX4、FTH、FTL、JNK蛋白含量和mRNA表达与模型组相比均明显降低，SOD活性升高(P＜0.05),尤其以JNK+N高组最明显。 结论:三重脑震荡模型大鼠在12h-72h时，出现脑组织铁沉积和海马神经元铁死亡特征，尤其48h最明显。给予脑震宁药物治疗后，模型大鼠海马神经元铁死亡得到改善，其机制可能与抗炎、降低过氧化反应和调控MAPK信号通路激活相关。其中，脑震宁可以通过抑制p38信号通路的激活发挥抗炎作用;通过抑制JNK信号通路激活降低过氧化反应，减少脑内过氧化物堆积和细胞内Fe2+的含量以降低铁沉积，从而改善神经元铁死亡。此外，脑震宁还可能通过抑制ERK信号通路的激活减轻神经元轴索损伤。
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