摘要
对虾能够持续携带一种或多种病毒病原体长期存活。当病原体、宿主和环境相互作用的动态平衡被打破时，就会导致传染性疾病的暴发。集约化养殖过程中产生的高浓度氨氮所引起的十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1,DIV1)的暴发给对虾养殖业造成了严重的经济损失。然而，目前对氨氮胁迫影响对虾潜伏感染的DIV1转为急性感染(暴发)的研究尚未见报道。本研究以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为研究对象，构建DIV1潜伏感染模型，确定了影响DIV1暴发的氨氮浓度，并在此基础上，从生理生化、mRNA和代谢物变化等多层面对不携带DIV1的凡纳滨对虾(PBS)、潜伏感染DIV1的凡纳滨对虾(DIV1)和氨氮胁迫导致DIV1暴发的凡纳滨对虾(A-DIV1)肝胰腺进行了研究，揭示了DIV1潜伏感染在氨氮胁迫下的暴发机制。研究结果可为对虾的病害防治策略提供参考，这对于构建有效防控病毒感染的对虾养殖模式具有重要意义。本文主要研究内容及结果如下: 1.凡纳滨对虾DIV1潜伏感染模型的构建 对健康的凡纳滨对虾人工注射4种浓度梯度的DIV1病毒粗提液(3.12×105、3.12×104、3.12×103 和 3.12×102 copies/μgDNA),连续观察 15 d,每天记录对虾的死亡数量。结果表明，当DIV1注射浓度为3.12×102copies/μgDNA时，15 d内对虾存活率为100％，对虾的DIV1检测结果呈阳性。定量检测结果表明，对虾的DIV1携带量在15 d内始终保持在2.87×102～3.07×103 copies/μg DNA之间,DIV1携带量较低，波动范围较小。因此，我们的数据表明当DIV1病毒粗提液注射浓度为3.12×102copies/μg DNA时，凡纳滨对虾处于DIV1潜伏感染状态。 2.确定影响DIV1暴发的氨氮浓度 使用5种浓度梯度的氨氮调配液(5mg/L、10mg/L、15mg/L、20 mg/L和25mg/L)对潜伏感染DIV1的凡纳滨对虾进行胁迫实验。结果表明，无论氨氮浓度为15 mg/L、20 mg/L和25 mg/L,均可导致潜伏感染DIV1的对虾和PBS组对虾出现大量死亡。而当氨氮浓度为10 mg/L时，PBS组对虾存活率高达90.91％,显著高于潜伏感染DIV1组(对虾最终存活率为27.27 ％),表明此氨氮浓度尚未超出PBS组对虾的耐受极限,PBS组对虾可以存活。而潜伏感染DIV1的对虾在氨氮胁迫下体内的DIV1复制加快，最终导致对虾死亡。当氨氮浓度为5mg/L时，潜伏感染DIV1的对虾最终存活率为81.82 ％,PBS组的对虾没有出现死亡，提示5mg/L的氨氮浓度可能不足以导致潜伏的DIV1暴发。因此，本研究初步确定影响DIV1暴发的水体氨氮浓度为10mg/L。 3.氨氮胁迫诱导DIV1潜伏感染转化为急性感染的抗氧化酶活和转录组学分析 对PBS组、DIV1组和A-DIV1组的凡纳滨对虾肝胰腺进行了转录组测序，并对抗氧化酶活性进行了研究。抗氧化防御酶活性分析表明，与健康对虾相比,潜伏的DIV1感染诱发了对虾的氧化应激，氨氮胁迫则加重了这一反应。通过转录组测序，共组装了 35,079个unigenes,平均长度为1,453 bp,N50为2,601 bp。多重比较分析显示，在DIV1 vs PBS组和A-DIV1 vs DIV1组中分别检测到4592个和3612个差异表达基因(DEGs)。进一步分析表明，凡纳滨对虾通过增强与免疫防御、细胞骨架、抗氧化防御、吞噬和能量代谢相关基因的表达水平和激活免疫通路来抵抗DIV1感染。潜伏的DIV1感染和宿主免疫之间可能存在着动态平衡，使凡纳滨对虾能够携带低病毒载量长期生存。然而，氨氮胁迫打破了这一平衡。在氨氮胁迫下，潜伏感染DIV1的凡纳滨对虾抗氧化防御酶活性显著下降,潜伏感染DIV1的凡纳滨对虾抗氧化能力失衡，机体氧化性损伤增加。此外，发挥抗病毒作用的免疫相关基因和通路受到抑制，并诱导细胞凋亡的发生。DIV1复制加快，宿主免疫系统和DIV1感染之间的平衡被打破，最终导致疾病的暴发。 4.氨氮胁迫诱导DIV1潜伏感染转化为急性感染的氨代谢酶活和代谢组学分析 对PBS组、DIV1组和A-DIV1组的凡纳滨对虾肝胰腺进行了代谢组测序和氨代谢酶活性变化研究。我们的数据表明凡纳滨对虾的免疫系统与潜伏的DIV1感染相互对抗之间似乎存在一种动态平衡:宿主免疫系统通过增强自身的氨基酸代谢、蛋白质合成来和脂质代谢来抵抗DIV1感染，同时通过上调抗氧化和抗炎症相关代谢物的水平来减轻潜伏DIV1感染诱导的氧化应激和炎症反应。然而，氨氮胁迫打破了这一平衡:一方面，对虾通过抑制氨基酸代谢来响应氨水平的升高，这会减弱宿主的免疫反应。另一方面，氨代谢酶活性的降低导致氨代谢受阻,过量的氨氮加重了宿主的炎症反应和氧化应激，这会导致DIV1复制加快，最终导致疾病的暴发。 5.转录组和代谢组的联合分析 通过对转录组和代谢组的联合分析发现，凡纳滨对虾通过增加TCA循环、脂肪酸生物合成和尿素循环中的代谢物水平和基因表达来抵抗潜伏DIV1感染。然而，在氨氮胁迫下，上述通路均受到抑制。在鞘磷脂通路中(Sphingolipid signaling pathway),作为神经酰胺(ceramide) 的前体二氢鞘氨醇(Dihydrosphingosine,dhSph)的代谢水平和催化二氢鞘氨醇合成神经酰胺的神经酰胺合成酶6(ceramide synthase 6,Cers)的基因表达显著增加。这表明氨氮胁迫可能通过鞘磷脂通路增加了神经酰胺的代谢水平进而诱发细胞凋亡。细胞凋亡相关基因均呈上调趋势证明了这一点。
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