摘要
目的: 彝药野拔子(Elsholtzia rugulosa Hemsl.)具有清热解毒、消食化积和止血镇痛功效，是彝族传统药物。课题组前期研究发现野拔子乙酸乙酯萃取部位(EAF)的总黄酮含量为184.91±3.86 mg/g,具有显著的α-葡萄糖苷酶抑制活性，强于阳性药阿卡波糖。此外，还具有抗氧化和乙酰胆碱酯酶及丁酰胆碱酯酶抑制活性。为了进一步提高野拔子总黄酮含量，本研究采用超声辅助提取方法对野拔子总黄酮提取工艺进行优化,再利用大孔吸附树脂进行富集，并对获得的总黄酮部位进行生物活性与化学成分研究,为野拔子的深入开发提供理论依据。 方法: 1.采用超声辅助提取的方法，通过单因素实验和Plackett-Burma实验考察乙醇体积分数、料液比、提取时间和超声功率对野拔子总黄酮提取率的影响。再通过响应面优化中的Box-Behnken设计方案探讨了各因素之间的关系，从而预测野拔子总黄酮最佳提取条件并进行实验验证。 2.将最佳提取工艺条件下获得的野拔子提取物分别用AB-8、HPD600、D101和ADS-17四种大孔吸附树脂进行分离，用不同比例的乙醇和水进行洗脱，获得不同的洗脱部位，并对其总黄酮含量进行测定，从而筛选出最适用于富集野拔子黄酮类成分的大孔吸附树脂。 3.对D101大孔吸附树脂分离所得的不同部位进行多种酶抑制活性和自由基清除活性测定，并利用Pearson关联分析，在总黄酮含量与生物活性之间进行关联分析。 4.利用现代分离技术对野拔子D101大孔吸附树脂50 ％乙醇洗脱部位(D50部位)进行化学成分分离，并通过核磁和质谱数据及文献比对鉴定化合物结构。 结果: 1.单因素实验结果表明在不同提取条件下总黄酮提取率会随因素水平波动而变化。通过Plackett-Burma实验设计发现，四种提取因素对野拔子总黄酮提取率均有显著的影响，显著性顺序由大到小为:乙醇体积分数＞料液比＞提取时间＞超声功率。进一步通过响应曲面图分析及实验验证获得最佳提取工艺条件:乙醇体积分数51 ％、超声功率400W、料液比1∶35、提取时间57 min,测得总黄酮提取率为11.81±0.06 ％。按照最佳提取工艺进行提取所得提取物(RSM)总黄酮含量为308.52±5.23 mg/g。 2.含量测定结果表明，与RSM总黄酮含量相比，经大孔吸附树脂富集后，黄酮含量均有不同程度提高。其中，D101大孔吸附树脂的50 ％洗脱部位总黄酮含量最高,为 436.86±9.59 mg/g。 3.D101大孔吸附树脂的水、20％、50％和70％乙醇洗脱部位α-葡萄糖苷酶抑制活性强于阳性对照药阿卡波糖。其中，D50部位α-葡萄糖苷酶抑制活性最强，IC50 值为3.17±5.31μg/mL,低于乙酸乙酯部位IC50值(7.05±0.63 μg/mL);所有萃取部位都不具有α-淀粉酶抑制活性。D50部位胆碱酯酶抑制活性强于乙酸乙酯部位，且此部位DPPH自由基清除活性最强，IC50值仅为5.42±0.06 μg/mL,与阳性对照药Vc(IC50值为3.73±1.41 μg/mL)相当。Pearson关联分析表明，总黄酮含量与α-葡萄糖苷酶抑制活性、胆碱酯酶抑制活性和自由基清除活性的IC50值呈负相关。 4.从D50部位分离得到9个化合物，分别是:豆甾醇(1)、4'',5-二羟基-7-甲氧基黄酮(2)、木犀草素(3)、田蓟苷(4)、(-)-丁香树脂酚-4-O-β-D-葡萄糖苷(5)、迷迭香酸甲酯(6)、β-谷甾醇(7)、白桦脂醇(8)和Obtusalin(9)。其中,白桦脂醇和Obtusalin为首次从野拔子中分离得到的五环三萜类化合物。 结论: 本研究通过优化提取工艺和大孔吸附树脂富集获得了野拔子总黄酮部位D50,其总黄酮含量高于萃取法所得乙酸乙酯部位，同时α-葡萄糖苷酶和胆碱酯酶抑制活性也有所提高。Pearson关联分析显示，总黄酮含量与α-葡萄糖苷酶抑制活性、胆碱酯酶抑制活性和自由基清除活性呈正相关。D50部位含有黄酮、萜类、甾体、苯丙素等多种成分。本研究为基于野拔子的有效部位新药创制提供了理论依据。
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