摘要
褪黑素是一种多功能调节分子，可刺激根系再生，调节植物生长发育的多个方面。为了深入了解褪黑素对黄瓜幼苗不定根形成的影响，本研究以 ‘新研4号’黄瓜为试验材料，对两叶一心的黄瓜幼苗进行以下4个处理:EW(浇灌清水)、EM(浇灌100μM褪黑素)、SW(下胚轴覆盖结合灌溉清水)和SM(下胚轴覆盖结合灌溉100 μM褪黑素)。调查褪黑素处理对黄瓜植株生长发育、果实产量及品质的影响。并对4个处理后黄瓜幼苗下胚轴的内源激素含量进行测定，结合RNA-seq分析，筛选出关键基因并进行验证，探究褪黑素调控黄瓜幼苗根系发育的机理。主要结果如下: 1.外源褪黑素促进了黄瓜幼苗根系和植株的生长发育。下胚轴覆盖(SW)诱导了黄瓜幼苗不定根的发生，若再施用外源褪黑素(SM)则显著促进不定根的形成，SM处理的不定根数是SW处理的2.25倍;而在下胚轴裸露条件下施用外源褪黑素(EM)则不能诱导不定根的形成。下胚轴覆盖(SW)处理幼苗的光合速率、根冠比、根长、根表面积和根体积较对照(EW)分别增加20.1％、22.3％、26.5％、30.6％和41.4％;下胚轴覆盖条件下，外源褪黑素(SM)处理的光合速率、根冠比、根表面积和根直径较浇灌清水(SW)处理分别增加了 16.3％、19％、27.2％和54％。下胚轴裸露条件下，外源褪黑素(EM)处理幼苗的光合速率、根冠比及根系形态指标较对照(EW)均增加了 6.9％以上。此外，苗期下胚轴覆盖(SW)还促进了定植后黄瓜植株的发育，使光合速率和产量分别提高了 15.9％和22％;下胚轴覆盖条件下，施用外源褪黑素(SM)则进一步促进了植株的生长发育，光合速率和产量较浇灌清水(SW)分别提高9.7％和12.5％。而下胚轴裸露条件下，施用外源褪黑素(EM)对黄瓜植株的生长发育及果实产量无显著影响。 2.外源褪黑素通过调节内源激素的含量水平调控黄瓜幼苗根系发育。下胚轴覆盖(SW)处理幼苗的内源IAA和茉莉酸含量较对照(EW)分别提高27.9％和19.1％,ACC和脱落酸含量分别降低了 28.9％和36.6％。在下胚轴覆盖条件下，浇灌褪黑素(SM)的幼苗下胚轴中内源IAN、水杨酸、茉莉酸和脱落酸含量分别是浇灌清水(SW)处理的4.1、11.9、1.76和1.48倍，独脚金内酯的合成显著受到抑制。而在下胚轴裸露条件下施用外源褪黑素(EM)后，幼苗下胚轴中IAA、茉莉酸、ACC、脱落酸和独脚金内酯的含量较对照(EW)分别降低了 30.5％、81.9％、11.1％、66.4％和 100％。 3.下胚轴覆盖条件下施用外源褪黑素显著诱导了不定根的发生和内源激素含量的变化。为了进一步了解这种效应背后的分子机制，进行了各处理后下胚轴部位的RNA-seq分析。在 EW 和SW 中共检测到2760个DEGs(与EW 相比，1381个基因下调，1379个基因上调)，这些DEGs为下胚轴覆盖所诱导的，显著富集到次生代谢物生物合成、光合作用、植物-病原菌互作和MAPK信号传导通路-植物。在SW与SM 比较组中共鉴定了 1296个DEGs(相对于SW,774个基因上调，522个基因下调)，这些DEGs为外源褪黑素所诱导的，显著富集到次生代谢产物合成、激素信号转导、糖代谢和植物-病原菌互作等相关的代谢途径。在EW和EM比较组中共检测到2537个差异表达基因(DEGs)(与EW相比，1420个基因下调，1117个基因上调)，DEGs主要富集到次生代谢物生物合成、植物激素信号转导、光合作用天线蛋白、光合作用和MAPK信号传导通路-植物等。数据分析发现，与对照(EW)相比，下胚轴覆盖(SW)处理上调了生长素、细胞分裂素、水杨酸、茉莉酸、油菜素内酯合成及信号转导相关基因和转录因子WRKYs、AP2/ERF-ERF、bHLHs、糖代谢、细胞壁相关基因的表达，下调了独脚金内酯合成及信号转导相关基因的表达。相对于下胚轴覆盖(SW),下胚轴覆盖结合施用外源褪黑素(SM)上调了生长素、水杨酸、茉莉酸、脱落酸合成及信号转导相关基因的表达，同时进一步上调了转录因子WRKYs、NACs、bHLHs、糖代谢和细胞壁相关基因的表达。相对于对照(EW),下胚轴裸露条件下外源褪黑素(EM)处理显著上调了水杨酸合成和细胞分裂素、乙烯、脱落酸、油菜素内酯信号转导相关基因的表达，下调了脱落酸、茉莉酸、赤霉素、独脚金内酯合成和茉莉酸、赤霉素信号转导相关基因的表达，而对大部分糖代谢和细胞壁形成相关基因的影响不显著。 4.基于 RNA-seq 分析结果，我们选取 CsPILS7、CsCM1,CsLOX2-1、CsWRKY34、CsPOD2L等差异基因进行了功能验证。研究结果表明:过表达CsPILS7和CsWRKY34显著增加了不定根数量，过表达CsCM1、CsLOX2-1和CsPOD2L促进了不定根的伸长，而沉默CsPILS7、CsCM1、CsLOX2-1、CsWRKY34和CsPOD2L抑制了不定根的发育。因此推测CsPILS7、CsCM1、CsLOX2-1、CsWRKY34和CsPOD2L可能在褪黑素诱导的不定根发生过程中发挥了重要作用。 总之，黄瓜幼苗不定根的发育受下胚轴覆盖和外源褪黑素的共同影响。下胚轴覆盖条件下外源褪黑素通过调控激素合成、信号转导、转录因子、糖代谢和细胞壁形成相关基因的表达，提高了生长素、水杨酸、茉莉酸和脱落酸的含量水平,降低了独脚金内酯的含量水平，显著诱导了黄瓜幼苗不定根的发育，促进了黄瓜植株的生长发育，提高了果实产量。
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