摘要
目的: 探讨SIRT1介导的线粒体损伤和自噬在亚砷酸钠(NaAsO2)致突触损伤的改变中的作用，为砷(As)的神经毒性机制研究提供一定的科学依据。使用SIRT1激活剂干预，观察干预后细胞中线粒体损伤和自噬及相关突触损伤的改变，探讨SIRT1对突触损伤的调控作用。同时，使用褪黑素(Melatonin,Mel)作为神经保护剂，证明褪黑素通过SIRT1信号通路调节NaAsO2诱导的突触损伤的恢复。 方法: 不同浓度亚砷酸钠(NaAsO2)或SRT1720或Mel染毒HT22细胞24h,采用CCK-8法检测细胞存活率。根据细胞存活率结果分为对照组、低剂量As(2μM)组、中剂量As(4μM)组、高剂量As(8μM)组、DMSO对照组、SRT1720组、高剂量 As(8μM)+Sirt1 激活剂(SRT1720)组、Mel 组、高剂量 As(8μM)+Mel组,在倒置显微镜下观察HT22细胞形态学改变，CCK-8法检测细胞活力;免疫荧光法检测SIRT1、C-FOS和LC3;免疫印迹法(WB)法检测HT22细胞SIRT1蛋白、线粒体蛋白(PINK1和Parkin)、自噬蛋白(LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ、P62)、突触蛋白(C-FOS、α-SYN)蛋白水平的改变，透射电镜观察线粒体和自噬小体等。 结果: 1、细胞存活率:HT22细胞存活率随着NaAsO2染毒剂量增加而逐渐降低。NaAsO2染毒24h后，细胞存活率整体呈下降趋势，随着NaAsO2染毒剂量增加,细胞存活率越低，16μM下降到达52％,差异具有统计学意义(P＜0.05)。 2、细胞形态变化:HT22细胞神经突长度和每个细胞的神经突数量显着减少，以及在NaAsO2处理后细胞体大小减小。亚砷酸钠染毒HT22细胞24h后，可明显抑制神经元突起的生长发育，表现为神经元最长突起长度明显降低、一级突起数目（PDN）明显减少和神经元突起生长指数（NOI）明显减少。SRT1720组和褪黑素组干预后可减轻NaAsO2引起的海马神经元损伤性改变。 3、细胞病理结构变化:对照组形态结构正常，线粒体结构清晰;染毒组线粒体肿胀且结构紊乱增多，可见线粒体损伤和自噬及自噬后残留的黑色素，自噬体增多;褪黑素干预染毒组和SRT1720干预染毒组，线粒体结构都有一定水平的紊乱，自噬体也相对较少。 4、SIRT1通路蛋白含量的变化:SIRT1蛋白表达水平在染毒组中都有降低趋势，并有统计学差异。2μM、4μM As和8μM As组HT22细胞内SIRT1含量随着染毒浓度的升高逐渐降低。NaAsO2和SRT1720干预处理后，干预染毒组与NaAsO2染毒组相比SIRT1蛋白表达水平升高。褪黑素的预处理SIRT1蛋白表达水平升高。在NaAsO2染毒后，染毒组中的SIRT1荧光强度与对照组相比减弱，尤其在8μM NaAsO2组中最为明显。激活剂SRT1720和褪黑素干预处理组对比8μM NaAsO2染毒组，SIRT1荧光强度升高。 5、细胞内线粒体功能变化:2μM As组、4μM As组和8μM As组的HT22细胞内PINK1和Parkin含量低于对照组（P＜0.05）。8μM As+SRT1720组和8μM As+褪黑素组PINK1和Parkin含量高于对照组。 6、自噬指标的变化:2μM As组、4μM As组和8μM As组HT22细胞内p62和LC3B含量高于对照组（P＜0.05）。8μM As+SRT1720组和8μM As+褪黑素组p62和LC3B含量低于对照组（P＜0.05）。褪黑素预处理减轻了 NaAsO2诱导的自噬（P＜0.05）。在染毒24 h后，染毒组中的LC3荧光强度与对照组相比增强，尤其在8μM NaAsO2组中更加明显。SRT1720和NaAsO2干预处理组对比8μM NaAsO2染毒组，LC3荧光强度降低。SRT1720和褪黑素干预处理同样也恢复了 LC3荧光强度。 7、突触相关蛋白相对表达量的变化:C-FOS和α-SYN表达水平随NaAsO2染毒剂量的增加而降低。NaAsO2染毒后C-FOS荧光强度呈下降的趋势。SRT1720和褪黑素干预减轻了 NaAsO2诱导的突触功能蛋白的表达，C-FOS荧光强度有了明显的恢复。 结论: 1.砷通过SIRT1调控线粒体损伤和自噬致突触损伤 2.褪黑素的神经保护作用可能由于激活SIRT1介导的线粒体损伤和自噬。
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