摘要
本文从以下几个方面进行论述： 1.巨型艾美耳球虫5种重组抗原对鸡树突状细胞功能的影响 巨型艾美耳球虫具有完整的免疫原性成分家族，可在宿主-寄生虫相互作用过程中促进免疫细胞的分化。树突状细胞（Dendritic cells，DCs）在宿主免疫调节中具有不可替代的作用。然而，缺乏对宿主树突状细胞具有免疫刺激作用的高级抗原的选择。本研究鉴定了巨型艾美耳球虫 Em14-3-3、EmROM1、EmROM2、EmMIC2 和Em8 共 5 个重组蛋白，并验证它们对鸡脾源树突状细胞的体外刺激作用。将培养的树突状细胞与重组蛋白孵育后获得的树突状细胞呈现出典型的树突状细胞形态。流式细胞术检测结果显示，树突状细胞相关标志物，包括主要组织相容性复合体(MHC) II类CD86、CD11c和CD1.1的表达上调。免疫荧光试验表明，重组蛋白能与鸡脾源性树突状细胞表面结合。此外，实时荧光定量PCR 结果表明，重组蛋白与DCs共孵育后，Toll样受体和 Wnt 信号通路不同基因表达明显上调。ELISA 结果表明，重组蛋白孵育后的树突状细胞分泌的IL-12和IFN-γ水平显著升高。然而，与对照组相比， rEmROM1、rEmROM2和 rEmMIC2组的 TGF-β显著升高，IL-10无明显改变。综上所述，在 5种可能的重组抗原中，rEm14-3-3能更有效地促进鸡脾源树突状细胞的免疫原性功能。 2. PLGA和壳聚糖纳米颗粒递送DCs刺激性抗原rEm14-3-3提高鸡抵抗巨型艾美耳球虫感染的免疫保护作用 巨型艾美耳球虫是一种顶复门胞内原虫，可导致鸡球虫病，该病严重危害禽类健康。本研究旨在将巨型艾美耳球虫重组抗原rEm 14-3-3装载PLGA和壳聚糖(CS)纳米颗粒（NPs），评估其增强抵抗巨型艾美耳球虫感染的免疫保护作用。表达和纯化rEm14-3-3抗原。将其装载PLGA和CS NPs，制成纳米亚单位疫苗。用扫描电镜观察装载rEm14-3-3抗原的NPs（PLGA/CS-rEm14-3-3）的形态。用PLGA-rEm14-3-3 NPs、CS-rEm14-3-3 NPs和rEm14-3-3分别对鸡进行肌肉注射免疫。评估鸡血清中细胞因子、IgY抗体水平、T淋巴细胞数量和抵抗巨型艾美耳球虫感染的保护作用。结果表明，装载rEm14-3-3抗原的PLGA和CS NPs 呈光滑的球形。与PBS组、pET-32a组、PLGA组和CS组相比，rEm14-3-3和 PLGA/CS-rEm14-3-3 NPs免疫鸡的血清中IFN-γ细胞因子水平显著提高(Plt;0.05)，提高鸡脾脏中CD4+/CD3+、CD8+/CD3+ T细胞亚群比例，引起血清IgY 抗体免疫应答。与CS-rEm14-3-3和裸抗原相比，PLGA-rEm14-3-3免疫鸡的CD4+/CD3+、CD8+/CD3+ T细胞的有效比值和血清IgY抗体水平均显著提高(Pamp;nbsp;lt;0.05)，并诱导更强的Th-1细胞介导的免疫。动物攻虫实验结果表明，与CS-rEm14-3-3 NPs组和rEm14-3-3组免疫鸡相比，PLGA-rEm14-3-3 NPs免疫鸡的相对增重(%)显著增加，病变评分显著降低，卵囊减少率显著提高。PLGA-rEm14-3-3 NPs免疫组的抗球虫指数（ 180.1 ）高于CS-rEm14-3-3 NPs 组(167.4)和裸抗原组(165.9)。综上， PLGA NPs可能是一种有效的抗原(rEm14-3-3)递送系统，作为纳米亚单位疫苗，该纳米亚单位疫苗能够提高鸡抵抗巨型艾美耳球虫感染的保护作用。 3. PLGA纳米颗粒递送rEm14-3-3 纳米疫苗抵抗柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫感染的免疫保护效果研究 鸡球虫病常由几种艾美耳球虫混合感染引起。rEm14-3-3 被鉴定为柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫的共同抗原。纯化的重组蛋白巨型艾美耳球虫 14-3-3（rEm14-3-3）用聚（D，L-丙交酯-共-乙交酯）（PLGA）纳米颗粒（NPs）包封，作为一种纳米偶联抗原递送系统。评估 rEm14-3-3 和包封 rEm14-3-3 抗原的PLGA NPs抵抗柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫感染的免疫保护作用。结果表明，与 PBS、pET-32a、PLGA 组相比，PLGA-rEm14 -3-3 NPs 肌肉注射(I/m) 免疫组鸡血清中 IFN-γ 细胞因子水平显著升高 (P lt;0.05) ， CD4+/CD3+、CD8+/CD3+ T 细胞数量增加，血清抗体介导的 IgY免疫反应增强。PLGA-rEm14-3-3免疫鸡 CD4+/CD3+、CD8+/CD3+免疫细胞百分比、血清 IgY 抗体水平和诱导的 Th-1细胞介导免疫水平均显著高于裸抗原组 (P lt;0.05)。动物攻虫实验结果表明，与仅免疫 rEm14-3-3 组相比，PLGA-rEm14-3-3 NPs 免疫组鸡的相对增重显著增加 (%)，病变记分显著降低，卵囊减少率提高。PLGA-rEm14-3-3 NPs 免疫组鸡的抗球虫指数(ACI)高于裸抗原免疫组。综上， PLGA-rEm14-3-3 NPs 纳米亚单位疫苗可增强rEm14-3-3 的免疫原性反应，提高鸡抵抗柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫和混合卵囊感染的免疫保护作用。 4. PLGA-rEm14-3-3纳米疫苗免疫程序的优化及其稳定性研究 优化了PLGA包封巨型艾美耳球虫14-3-3抗原的纳米疫苗的免疫程序，包括不同途径、不同剂量、不同免疫时间和鸡的首免日龄。评估了纳米亚单位疫苗的稳定性，包括储存时间和温度。通过卵囊减少率、病变评分、平均增重和抗球虫指数（ACI）评估纳米亚单位疫苗的免疫效果。将鸡随机分成相应的组（每组25只），设置阳性组、阴性组和对照组（PBS组）。结果表明，最佳免疫剂量为50μg，最有效的促进保护作用的途径为肌内注射免疫。两次免疫组（鸡7日龄和14日龄免疫）的ACIgt; 179，高于单次免疫组，说明其免疫保护效果优于单次免疫组。纳米亚单位疫苗在不同时间和温度条件下的免疫效果都十分稳定。综上，PLGA-rEm14-3-3 NPs疫苗的最佳免疫程序为分别在鸡7日龄和14日龄进行肌肉注射免疫50 μg PLGA-rEm14-3-3 NPs。
NETL