摘要
猪链球菌（Streptococcus suis）是一种重要的人畜共患病原，不仅引起猪发生脑膜炎、败血症和心内膜炎等严重感染，对养猪业造成重大的经济损失，而且可通过接触病猪或摄入受污染的猪肉产品而感染人，导致发生病程凶险、致死率极高的中毒性休克综合征，给人类健康带来威胁。由于血清型众多，猪链球菌疫苗效果不佳，抗菌药物仍是兽医临床治疗和控制猪链球菌感染最为有效的方法，但近年来随着抗菌药物的广泛使用以及不合理用药，使得猪链球菌对常用抗菌药物的敏感性下降。大环内酯类-林可胺类-链阳菌素B类（MLSB）抗菌药，以及酰胺醇类-噁唑烷酮类（PhO）药物是兽医和人医临床抗革兰阳性菌感染的重要药物。然而，我们长期的猪链球菌流行病学监测发现 MLSB/PhO 类耐药菌株在猪链球菌中呈逐年上升的趋势。可移动遗传元件（MGEs）是介导耐药基因水平快速传播的重要原因，但介导上述两类耐药基因在猪链球菌之间或者不同种细菌之间水平传播的 MGEs 及其水平转移机制尚未完全阐明。基于此背景，本论文以猪链球菌为研究对象，在调查了猪链球菌2005~2018年来对常用抗菌药物耐药性变化趋势的基础上，分析其对MLSB和PhO两类抗菌药物的耐药机制；并进一步探讨了 MLSB和 PhO 两类抗菌药物的主要耐药基因[erm(B)和 optrA]在猪链球菌不同菌株之间以及猪链球菌与肠球菌之间水平传播的分子机制，为阐明MLSB-PhO类耐药猪链球菌快速扩散的原因提供充分证据。主要研究内容如下： 1 猪链球菌对常用抗菌药耐药性变迁及携带erm(B)-optrA猪链球菌的遗传特征分析 本研究选取了2005~2018年之间分离的320株猪链球菌，分析了这些菌株对常用抗菌药物特别是 MLSB和 PhO 类抗菌药物的耐药变化趋势以及相关耐药基因的携带率，最后重点分析erm(B)和optrA阳性猪链球菌的分子遗传特征。结果显示，从2005年到 2018 年，猪链球菌对所有抗菌药物的耐药率均呈现上升趋势，其中菌株对四环素的耐药率从2005年以来始终维持在较高水平（gt;92％），而对MLSB类（从48％~76％增加至96％以上）和PhO类（从1％~11％上升至41％~52％）抗菌药物的耐药率随时间变化均显著升高。Tet-MLSB-PhO耐药菌株涉及的耐药基因主要为tet(O)（79.06％， 253/320）、erm(B)（76.56%，245/320）和 optrA（23.44%，75/320）。值得注意的是，同时携带erm(B)和tet(O)基因的菌株占erm(B)阳性猪链球菌的90.20%（221/245），所有optrA阳性菌株均同时携带erm(B)基因。MLST和PFGE分子分型方法检测erm(B)-optrA阳性菌株的遗传特征发现猪链球菌MLST序列型别较为分散，75株猪链球菌中有8株未能得到可靠的序列结果而无法分型，剩余的67株菌共分为50个ST型，分属于多个克隆群。而PFGE结果显示75株菌的图谱相似性系数在20%~100%之间，共分为50群，表明我国携带erm(B)-optrA的猪链球菌遗传差异大、多样性高。 2 不同MGEs介导erm(B)在猪链球菌种内和与肠球菌属间水平转移的机制 为探究引起MLSB类药物广泛耐药的erm(B)的传播及其与tet(O)基因的共转移机制，本试验随机挑选6株同时携带erm(B)和tet(O)基因的猪链球菌用于种内接合试验。结果显示菌株 YSB17、YSJ15 和 JHJ17 分别以(5.75±1.18)×10-8、(3.84±1.29)×10-8和(4.31±1.53)×10-8的频率成功地在猪链球菌不同血清型的菌株之间转移了 erm(B)基因，转移元件为整合性接合元件 ICESsuYSB17_rplL 和 ICESsuYSJ15_rplL 以及基因组岛GISsuJHJ17_rpsI。其中ICESsuYSB17_rplL和ICESsuYSJ15_rplL仅有5个核苷酸的差异，同时携带erm(B)和tet(O)基因，属于ICESa2603家族ICEs，具有完整的整合和接合模块，在猪链球菌中特异性整合到ICESa2603家族的保守位点rplL基因的3''-末端。GISsuJHJ17_rpsI同时携带erm(B)、高水平的链霉素抗性基因aadE和壮观霉素抗性基因spw-like，并整合到受体菌rpsI基因的3''-末端。PCR检测结果显示ICESsuYSB17_rplL或 GISsuJHJ17_rpsI 在猪链球菌中可同时以整合到染色体上的整合形式和染色体外的环状形式存在。随后将这 3 株在不同血清型猪链球菌中接合成功的菌株作为供体菌，以粪肠球菌JH2-2为受体菌，验证携带erm(B)的ICEs和GI是否能发生属间的水平转移。结果显示ICESsuYSB17_rplL和GISsuJHJ17_rpsI可从猪链球菌转移至粪肠球菌，接合频率分别为(5.60±2.10)×10-10和(6.12±1.67)×10-10，且接合子表现出了相应转移耐药基因的耐药表型。GISsuJHJ17_rpsI 在肠球菌中同样整合到 rpsI 位点，但ICESsuYSB17_rplL转移到肠球菌时并非整合到rplL位点，而是由IS4家族的插入序列ISSsu2介导的复制-导入（copy-in）方式与染色体形成共整合，该共整合方式为随机插入，无特异性整合位点。ICESsuYSB17_rplL在属间转移过程中丢失了含有tet(O)在内的大小约为25 kb的一段序列，但同时又复制了包括T4SS基因virB4、复制起始基因repA和整合酶基因int在内的约为20 kb的一段序列。接合子与相应受体菌的体外适应性代价试验结果表明，除以copy-in方式获得ICE的接合子在体外竞争试验中表现出一定的适应性代价外，其余接合子均未显示出明显的适应性代价。 3 不同MGEs介导optrA在猪链球菌中水平转移的机制 为探究optrA基因在不同菌株之间水平传播的机制，本试验选取部分optrA阳性且氟苯尼考耐药菌株作为供体菌进行接合转移试验，其中有6株菌（AH0906、SH0918、AKJ47、414、416 和 FJSM5）成功获得接合子，转移频率分别为(1.39±0.46)×10-5、(5.70±1.06)×10-8、(5.99±1.53)×10-6、(5.84±2.15)×10-6、(4.36±1.04)×10-6和(5.52±2.71)×10-9。进一步对接合成功的6株optrA阳性菌株进行S1-PFGE分析，证实optrA可定位于质粒（1株）和染色体（5株）。进而选择4株菌（AH0906、SH0918、AKJ47和FJSM5）进行全基因组测序，分析optrA的遗传背景。结果显示SH0918含有一个携带optrA基因的质粒pSH0918，与猪链球菌质粒pHN105和p3366具有很高的同源性，稳定性试验表明该质粒在无抗菌药物选择压力的情况下，仍可以在群体中稳定维持。菌株AH0906和AKJ47中携带介导optrA基因水平转移的元件为ICESsuAH0906_SSU0877和ICESsuAKJ47_SSU1797，它们同属于ICESsuYZDH1家族ICEs，其骨架结构与无乳链球菌2603V/R的ICESa2603 核心基因的同源性超过90%，整合模块由三联体丝氨酸整合酶组成。这2个ICEs在供体菌中分别整合到SSU0877和SSU1797位点，但在接合子中除整合到与供体菌相同的主要位点外，还可以分别整合到次要位点 SSU179和SSU1943，而SSU1943整合位点此前未曾报道过，其编码MutT/Nudix水解酶家族蛋白MutT，与细菌DNA的错配修复密切相关。菌株FJSM5中的optrA基因位于前噬菌体ФSsuFJSM5，它整合到可移动遗传元件的保守插入热点rumA，遗传环境比较分析显示ФSsuFJSM5与ФSC181、ФSsuYSJ17、Фm46.1和ФSsUD.1的前噬菌体骨架结构具有较高的同源性，属于Φm46.1-like前噬菌体。除optrA外，ФSsuFJSM5还携带MLSB类耐药基因erm(B)及氨基糖苷类耐药基因aadE和ant(9)-I。尽管携带optrA基因的可移动遗传元件不同，但在这4株菌中optrA基因的上下游均存在方向相同的IS6家族插入序列IS1216E，形成大小不同的复合转座子，通过反向PCR证实4种复合转座子均可切除环化形成可转座单元（TU），且由于菌株AKJ47的IS1216E中额外插入一个ISSsu6，其可形成两种大小不同的TU。最后，适应性代价分析表明，虽然6株接合子在获得不同的可移动遗传元件后在 THB 培养基中的生长状态不同，但它们与受体菌共同培养时均存在一定的适应性代价。 综上所述，本研究系统分析了猪链球菌对常用抗菌药物的耐药变化趋势，发现对Tet类、MLSB类和PhO类抗菌药物耐药相关基因主要为tet(O)、erm(B)和optrA，介导上述耐药基因水平转移的相关可移动基因元件有ICEs、质粒和（或）前噬菌体。首次发现猪链球菌中的ICESsuYSB17_rplL由插入序列ISSsu2介导，以copy-in方式发生属间转移，且转移过程中同时存在复杂的缺失、复制等现象，并发现ICESsuYZDH1家族ICEs的新整合位点SSU1943。本研究结果提示PhO类耐药基因optrA在猪链球菌中逐年上升并广泛流行，会对噁唑烷酮类药物治疗耐药革兰阳性菌提出挑战，需要引起重视。
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