摘要
猪链球菌（Streptococcus suis）是一种重要的人畜共患病原菌，抗菌药物是防治猪链球菌病的首选。我们对猪链球菌耐药性监测的过程中发现猪链球菌对大环内酯类-林可酰胺类-链阳菌素B类（Macrolides-Lincosamids-Streptogramin type B，MLSB）、四环素类抗生素的耐药性日趋严重，且发现菌株对β-内酰胺类抗生素的耐药率也在不断地缓慢上升，引起我们的重视。已报道肺炎链球菌、无乳链球菌等链球菌属细菌对β-内酰胺类抗生素的耐药机制主要是青霉素结合蛋白（Penicillin-binding proteins，PBPs）的变异，我们也在猪链球菌的 PBP2X 中发现与链球菌已报道的耐药相关突变位点类似的氨基酸替换，但这些位点的氨基酸替换是否与猪链球菌对β-内酰胺类耐药相关尚待证实。因此，本论文基于实验室于2016~2018年间分离菌株中筛选的107株β-内酰胺类耐药猪链球菌的耐药性数据基础，研究β-内酰胺类抗生素耐药猪链球菌的分子分型以了解其流行特点与传播特征，此外还重点研究 PBP2X 耐药相关位点氨基酸替换在猪链球菌对β-内酰胺类抗生素耐药中的作用。主要研究内容如下。 一、青霉素耐药猪链球菌的分子分型及PBPs位点差异分析 首先采用美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute， CLSI）推荐药敏试验方法研究临床分离的 107 株 β-内酰胺类抗生素耐药猪链球菌对其它18种药物的敏感性。结果显示β-内酰胺类抗生素耐药猪链球菌对其他抗菌药也呈现不同程度的耐药。其中，菌株对大环内酯类抗生素（红霉素、替米考星和泰拉菌素）、林可胺类抗生素（克林霉素和林可霉素）以及四环素类抗生素（四环素和多西环素）的耐药率最高，均达95%以上；对酰胺醇类（氯霉素和氟苯尼考）、氨基甙类抗生素（庆大霉素和大观霉素）、氟喹诺酮类抗菌药（麻保沙星和恩诺沙星）、截短侧耳素类抗生素（泰妙菌素和沃尼妙林）和利奈唑胺的耐药率在45%~79.4%之间；菌株对利福平（13.1%）和万古霉素（5.6%）仍保持较低的耐药率。表明猪链球菌对常用抗菌药产生较为严重的耐药现象。根据WGS序列中荚膜多糖簇（Capsule sequence cluster，CPS）序列信息显示，其中94株猪链球菌属于33种血清型，NCL1型（14株）最多，其次为 30 型（10 株）。比对 7 个管家基因进行多位点序列分型（Multilocus sequence typing，MLST），其中87株能成功划分为59个ST型，其中24个为新ST型，数量较多的为ST-1317（7株）和ST-1319（6株）；经goeburst分析，ST-1068、ST-1077和ST-1320，ST-1143和ST-1324，ST-1086和ST-1325，ST-1063和ST-1085亲缘性较高，且大多分布于不同的养殖场，表明猪链球菌在传代过程中出现变异且在江苏地区存在小范围传播。通过比较耐药菌株和P1/7菌株的PBPs序列，发现耐药菌株的PBP1a、PBP1b、PBP2a和PBP2b虽存在少量差异，但并非是已知介导青霉素耐药的位点，而PBP2X中具有已报道的链球菌属对β-内酰胺类抗生素耐药相关的突变位点，主要包括V399I、T340M、M341I、I373V、M401T、T551S、A371V等。PBP2X进化树显示存在M341I、I373V、M401T位点差异的菌株位于同一个分支，且这些菌株对青霉素呈现高水平耐药，提示这三个位点替换在介导青霉素高水平耐药中起到重要作用。由于PBPs的保守基序SXXK、KS/TG、SXN中的替换很大程度决定了其与β-内酰胺类抗生素的亲和力，且我们的结果显示猪链球菌 PBP2X S339TMK 中 M341I替换所在的分支与青霉素高水平耐药有一定相关，故后续进一步研究 PBP2X M341I替换在介导β-内酰胺类高水平耐药中的作用。 二、猪链球菌PBP2X的表达及其与β-内酰胺类抗生素的亲和力分析 为了解PBP2X的M341I替换是否能导致PBP2X和β-内酰胺类抗生素亲和力下降，本文采用定点突变技术将敏感株 P1/7 的 PBP2X 保守基序 S339TMK 中的蛋氨酸（Met，M）替换为异亮氨酸（Ile，I）、临床分离耐药菌株GMJ14和FJSM4的PBP2X保守基序S339TIK中的Ile回复替换为Met，然后将上述菌株以及敏感株P1/7、分离耐药株 GMJ14 和 FJSM4 的 PBP2X 分别进行原核表达。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）诱导表达、SDS-PAGE 验证，表明各菌株的GST-PBP2X均可在上清中大量表达。利用GST亲和层析柱纯化GST融合蛋白，TEV酶去除GST标签，经脱盐柱脱盐得到具有活性、纯度较高的PBP2X蛋白。在激发光280 nm、发射光320 nm的条件下测定上述表达的各种PBP2X分别与青霉素钠、阿莫西林、头孢噻呋和头孢噻肟钠共孵育后的荧光强度变化，通过计算酰化效率以评价PBP2X与上述药物的亲和力。结果表明：敏感株P1/7的PBP2X的M341位点的氨基酸由蛋氨酸替换为异亮氨酸后，其与青霉素和阿莫西林的酰化效率分别下降2倍和1.8倍，替换前后变化差异显著（Plt;0.05），但是对头孢噻呋和头孢噻肟的酰化效率变化不显著(Pgt;0.05)。耐药株GMJ14和FJSM4回复突变的PBP2X，即341位点的异亮氨酸（I）回复突变为蛋氨酸（M）后，其与青霉素和阿莫西林的酰化效率升高 1.3~2.2倍，差异显著（Plt;0.05），但与头孢噻呋和头孢噻肟的酰化效率变化不显著(Pgt;0.05)。以上结果从正反两个方面证实猪链球菌的PBP2X的M341I替换可导致其与青霉素类抗生素的亲和力下降，但对头孢类抗生素的亲和力影响不显著。 综上，本论文分析了青霉素耐药猪链球菌的流行特点与传播特征以及PBPs位点差异与青霉素耐药的联系，并进一步证实猪链球菌PBP2X的341位点的M-I氨基酸替换会导致其与β-内酰胺类抗生素尤其是青霉素类的亲和力下降，解释了这些菌株对青霉素类抗生素敏感性下降的原因。该研究结果可为最终阐明猪链球菌对青霉素类抗生素耐药机制奠定基础，为猪链球菌病的临床合理用药和耐药性控制提供参考。
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