摘要
目的: 建立空气细颗粒物(Fine particulate matter,PM2.5)诱导大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(RLE-6TN)损伤模型，探讨PM2.5诱导RLE-6TN细胞损伤及凋亡相关机制，探索红景天苷(Salidroside,SAL)对PM2.5诱导RLE-6TN细胞凋亡的保护作用，为阐明PM2.5引起呼吸道损伤机制和SAL保护作用机制提供实验基础。 方法: 1.构建PM2.5损伤RLE-6TN细胞模型 PM2.5样品用RPMI-1640细胞培养基制作颗粒物悬液。将RLE-6TN细胞暴露于浓度为0,25,50,100,200,400 μg/mLPM2.5悬液24h,用倒置显微镜观察细胞形态，MTT法测定细胞活力，微板法测定培养液中乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)活力，激光共聚焦显微镜观察细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)、细胞凋亡、线粒体膜电位水平，同时微板法、WST-1法、TBA法分别检测抗氧化蛋白谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、总超氧化物歧化酶(Total Superoxide Dismutase,T-SOD)和氧化产物丙二醛(Malondialdehyde,MDA)指标，试剂盒结合酶标仪检测 Caspase-3 和 Caspase-9相对活力水平，以确定PM2.5损伤RLE-6TN细胞的毒性作用和相关机制。 2.探索SAL对PM2.5诱导细胞损伤及细胞凋亡的保护机制 40、80和160 μM的SAL预处理细胞24h,加入50μg/mL PM2.5染毒24h,观察细胞形态改变，检测细胞活力、LDH漏出量和氧化应激指标ROS、GSH、T-SOD和MDA,半定量分析线粒体膜电位、细胞凋亡水平，同时Western blot检测细胞内 Bcl-2、p53、BAX、Fas、FADD、Cytochrome c、Caspase-3 和 Caspase-9蛋白表达，以确定SAL对PM2.5诱导RLE-6TN细胞损伤及凋亡保护作用的具体机制。 结果: 1.PM2.5诱导RLE-6TN细胞损伤 20×物镜观察下，对照组细胞形态呈多边形，连接紧密，PM2.5组悬浮颗粒增多，细胞形态皱缩变圆，漂浮细胞变多，随PM2.5剂量增加细胞活力显著下降（P＜0.05）。PM2.5暴露的细胞培养基中LDH活性增加，≥50μg/mL PM2.5组与对照组相比，有更多细胞内LDH释放到培养液中（P＜0.05）。随着PM2.5剂量升高，细胞内ROS的产出和氧化物MDA的生成量进一步增加，抗氧化蛋白GSH、T-SOD活力下降，≥50μg/mL PM2.5组与对照组相比，有统计学差异（P＜0.05）。PM2.5致细胞内线粒体膜电位显著降低，≥25μg/mLPM2.5组与对照组相比，有统计学差异（P＜0.05）。ROS和线粒体膜电位水平存在负相关（r=-0.9294,P＜0.05）。≥100μg/mLPM2.5染毒可致细胞凋亡水平及凋亡蛋白活力显著升高，与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）,ROS与Casepase-3及 Casepase-9 活力呈显著正相关（r=0.8881 和 0.9205,P＜0.05）。2.红景天苷对PM2.5诱导RLE-6TN细胞损伤及凋亡的保护作用 40×物镜观察下，各SAL+PM2.5组细胞形态相比PM2.5组有所好转，漂浮细胞和皱缩细胞减少，细胞间隙缩小。与PM2.5组相比，160μM+PM2.5组细胞活力明显上升（P＜0.05）。细胞培养基中LDH活性随着SAL剂量增加而降低，≥80μmol/L SAL组与PM2.5组相比，有统计学差异（P＜0.05）。随着SAL剂量增加，细胞内ROS水平和MDA含量逐渐下降，氧化应激指标水平（GSH和T-SOD）呈现上升趋势，在160μmol/LSAL浓度处理下，以上指标与PM2.5组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。SAL能明显缓和PM2.5致细胞线粒体膜电位降低、凋亡水平升高，160μM+PM2.5组与PM2.5组相比，有统计学差异（P＜0.05）。PM2.5 组细胞内 p53、BAX、Fas、FADD、Cytochrome c、Caspase-3和Caspase-9表达升高，Bcl-2下降。SAL预处理可在一定程度上降低PM2.5暴露导致的 p53、BAX、Fas、FADD、Cytochrome c、Caspase-3 和 Caspase-9 升高和 Bcl-2 下降。≥80μmol/L SAL 组与 PM2.5 组相比，p53、BAX、Cytochrome c、FADD、Caspase-3 和 Fas 差异有统计学意义（P＜0.05）。≥160μmol/L SAL 组与PM2.5组相比，Bcl-2和Caspase-9差异有统计学意义（P＜0.05）。 结论: 1.PM2.5可造成大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤，通过诱发氧化应激、线粒体膜电位去极化，最终引起细胞凋亡。 2.SAL通过提高细胞活力、抵抗氧化应激、抑制线粒体凋亡通路p53、BAX、Cytochrome c 和死亡受体 Fas、FADD、Caspase-3、Caspase-9 的表达及增强 Bcl-2表达来减轻PM2.5诱导的RLE-6TN细胞凋亡。
NETL