摘要
研究目的: 抑郁症作为全球疾病负担的主要来源之一，位列精神障碍疾病负担之首。鉴于全球抑郁症持续且愈发严重的现状，世界精神病学协会去年在《Lancet》发表了一份关于抑郁症的重大报告。该报告明确指出全球抑郁症危机尚未解决，同时呼吁各界采取积极应对，缓解抑郁症所带来的沉重负担。从目前的研究证据来看，抑郁症在其发病率、临床症状及药物疗效等方面均呈现显著的性别差异。尽管已有研究从心理学与生物学方面解释这些差异，但其确切机制仍未阐明。针对抑郁症性别差异及其机制的研究，不仅有助于深刻理解和认识抑郁症的病理生理机制，并且对于促进抑郁症分类诊断、精准施策以及提升抗抑郁治疗效果具有十分重要的意义。 抑郁症的发病机制假说众多，其中慢性应激被认为是抑郁症重要的风险因素，而下丘脑-垂体-肾上腺皮质( Hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA)轴的功能失调在应激致抑郁中发挥关键作用。临床及动物研究显示，应激引起的HPA轴激活存在性别差异，然而截至目前，关于慢性应激诱发小鼠抑郁样行为及HPA轴激活的性别差异尚无统一且充分的解释。 小胶质细胞是中枢神经系统的主要免疫效应细胞，在维持神经免疫平衡中发挥重要作用。一般认为，小胶质细胞的激活可朝向两个不同方向分化，进而发挥截然不同的两种功能：促炎表型为经典激活状态，主要产生大量促炎细胞因子，被称为M1型极化。而抗炎表型则为选择性激活，可产生多种抗炎细胞因子，被称为M2型极化。研究表明,小胶质细胞激活所产生的促炎及抗炎细胞因子被证明与抑郁症的发生发展密切相关。此外，检测这些细胞因子的表达，还有助于我们观察小胶质细胞的激活状态，为评估小胶质细胞在体内的功能提供可靠依据。 作为一种关键的神经营养因子，脑源性神经营养因子( Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)在成年海马的神经生长、存活、成熟、分化及突触可塑性中发挥重要的作用。临床研究报道，抑郁症患者血清BDNF水平较低，抗抑郁治疗可促进BDNF的产生，而慢性应激则能抑制BDNF的合成。除此之外，促炎及抗炎细胞因子也可通过一定途径影响海马区BDNF及其受体的表达与功能，提示神经炎症可能通过调节BDNF水平影响抑郁症的发生和发展。 进一步而言，我们课题组前期研究表明，含有NACHT, LRR和PYD结构域的蛋白质 3 (NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3, NLRP3 )炎性小体在应激致抑郁中扮演重要角色，抑制NLRP3炎性小体可有效改善雄性小鼠小胶质细胞激活与神经炎症、上调BDNF水平，同时缓解小鼠抑郁样行为。由此推测，“小胶质细胞-神经炎症-BDNF”可能在抑郁症中发挥重要作用，海马区小胶质细胞的极化状态可影响神经炎症及BDNF水平，这或许是应激诱发小鼠抑郁样行为呈现性别差异的潜在机制，而NLRP3炎性小体可能在此通路中发挥调控作用。 由此，本课题拟在动物、细胞及分子层面，深入探究小胶质细胞极化在慢性应激诱发小鼠抑郁样行为性别差异中的作用，初步阐明抑郁症性别差异的可能机制，为促进抑郁症分类诊断、精准治疗及提升抗抑郁疗效提供理论依据和实验证据，为抑郁症临床诊疗提供新思路和新靶点。 研究方法: (一)慢性应激诱发小鼠抑郁样行为 1、采用慢性不可预见性轻度应激(Chronic unpredictable mild stress,CUMS)作为主要的应激范式，对雌雄小鼠进行为期4周的应激。 2、通过行为学检测(包括糖水偏爱、悬尾、旷场实验)，评估小鼠抑郁样行为。 3、应用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测慢性应激模型小鼠的血清皮质酮(Corticosterone,Cort)水平。 (二)慢性应激对小鼠海马“小胶质细胞-神经炎症-BDNF”的作用 1、 应用反转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)法检测慢性应激小鼠海马区小胶质细胞的极化情况。 2、应用RT-PCR法检测慢性应激小鼠海马区炎性细胞因子水平。 3、应用RT-PCR和WB法检测慢性应激小鼠海马区BDNF及其受体水平。 (三)雌激素对体外炎性刺激小胶质细胞的影响 1、利用雌二醇(estradiol,E2)及脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)刺激 BV2 小胶质细胞株，建立体外细胞模型。 2、应用WB法检测E2对小胶质细胞激活、炎性细胞因子分泌、BDNF水平的影响,并使用雌激素受体抑制剂氟维司琼进行干预和验证。 3、应用WB法检测E2对NLRP3炎性小体激活的影响，并使用雌激素受体抑制剂氟维司琼进行干预和验证。 4、应用WB法检测NLRP3炎性小体特异性抑制剂MCC950对E2敏化的小胶质细胞激活、炎性细胞因子、BDNF表达变化的影响。 研究结果: (一)慢性应激诱发小鼠抑郁样行为的性别差异 1、慢性应激导致小鼠体重增长的速度及幅度呈现性别差异，雌性小鼠体重增速较雄性小鼠减缓更早，雌性应激组小鼠的相对体重低于雄性应激组小鼠。 2、慢性应激诱发小鼠的抑郁样行为呈现性别差异，雌性小鼠在糖水偏爱及旷场实验中显示出的抑郁样行为更加明显。 3、慢性应激诱发小鼠HPA轴的激活呈现性别差异，雌性小鼠HPA轴对慢性应激刺激更为敏感。 （二）慢性应激对小鼠海马“小胶质细胞-神经炎症-BDNF”作用的性别差异 1、慢性应激诱发的小鼠海马区小胶质细胞的极化存在性别差异，雌性小鼠与雄性小鼠M1型极化均明显增加，但雄性小鼠M2极化显著增加，雌性小鼠M2极化显著减少。 2、慢性应激诱发小鼠海马区促炎及抗炎细胞因子的表达呈现性别差异，雌性小鼠与雄性小鼠促炎细胞因子上调，但雌性小鼠抗炎细胞因子显著下降，雄性小鼠无显著变化，这与前述小胶质细胞极化的结果相符。 3、慢性应激诱发小鼠海马区BDNF及其受体TrkB的变化呈现性别差异，雌性小鼠BDNF及其受体TrkB表达水平较雄性小鼠下降的更多。此外，小鼠海马区BDNF与抑郁样行为和炎性细胞因子具有相关性，且同样存在性别差异。 （三）雌激素对体外炎性刺激小胶质细胞的影响 1、LPS及LPS+E2刺激均可激活小胶质细胞，但二者间未见明显差异。 2、E2可敏化LPS诱导的炎性细胞因子、BDNF的表达，且其作用可被氟维司琼逆转。 3、E2可敏化LPS诱导的NLRP3炎性小体激活，且其作用可被氟维司琼抑制。 4、E2对LPS诱导的炎性细胞因子水平、BDNF表达变化的影响可被NLRP3特异性抑制剂MCC950所阻断。 研究结论: 1、慢性应激诱发的小鼠抑郁样行为呈现性别差异，雌性小鼠的抑郁样行为更为明显，且雌性小鼠HPA轴的激活水平更高。 2、慢性应激诱发的小鼠海马区小胶质细胞极化、炎症细胞因子、BDNF水平均呈现性别差异，其所形成的“小胶质细胞-神经炎症-BDNF”可能是慢性应激诱发小鼠抑郁样行为性别差异的重要机制。 3、低浓度的E2可敏化LPS诱导的小胶质细胞促炎反应，并降低BDNF的表达，表明雌激素对小胶质细胞炎症细胞因子以及BDNF具有调节作用，且NLRP3炎性小体在其中发挥重要作用。
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