摘要
目的：肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，而我国是肺癌高发国家之一。目前肺癌的治疗方式主要包括外科手术治疗和药物治疗，但是手术治疗容易引起并发症，常用化疗药物副作用大，因此需要寻找新的高效低毒药物，而天然产物或许是一个突破点。据此本课题对课题组自有天然产物库进行抗肺癌活性的筛选，发现黄酮类化合物芹菜素在低氧环境中具有良好的选择性抗肺癌作用。本课题确证了芹菜素在体内外抗肺癌的作用，结合定量蛋白质组学和定量代谢组学揭示其药效机制，并进一步通过化学蛋白质组学探究芹菜素抑制人肺癌细胞A549的直接药效靶标，以期为肺癌的治疗及新的抗癌药物开发提供新思路。 方法：第一，从细胞水平上明确芹菜素的抗肺癌药效。我们采用CCK-8法、平板细胞克隆形成实验、吉姆萨染色法、流式细胞术和Western Blot等方法探究低氧条件下芹菜素对A549细胞的作用。第二，明确芹菜素的药效机制网络。我们通过基于稳定同位素二甲基化标记的定量蛋白质组学技术和定量代谢组学技术，分析低氧环境下芹菜素作用于A549细胞后全蛋白组和代谢物的变化，探寻芹菜素发挥作用的关键通路。第三，鉴定芹菜素的直接作用靶标。我们利用基于活性探针的化学蛋白质组学技术进一步鉴定了芹菜素直接作用的靶标，再借助RNA干扰技术对目标蛋白进行了敲低，通过CCK-8实验和流式细胞术检测靶蛋白对芹菜素抑制A549细胞的影响，并采用Pull-down实验验证芹菜素与靶蛋白的相互作用。第四，在动物层面上明确芹菜素的抗肺癌药效。我们借助乌拉坦构建小鼠肺癌模型，从小鼠体质量、生长情况、病理切片等方面评价芹菜素的体内抗肺癌活性。 结果：首先，CCK-8、吉姆萨染色和平板克隆形成实验结果显示芹菜素低氧条件下能抑制A549细胞的细胞活力和克隆形成能力，流式细胞术结果表明在低氧条件下25 μM芹菜素能时间依赖性地诱导A549细胞凋亡，随后我们开展了Western Blot实验，结果证明芹菜素可以下调A549细胞Bcl-2与Bax的比值和Caspase 9、PARP的表达，上调Cytochrome C、Caspase 3、Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 9和Cleaved PARP的表达，从而促进A549细胞凋亡。其次，我们对定量蛋白质组学和代谢组学实验结果进行分析，发现芹菜素低氧条件下主要干扰了A549细胞的糖酵解。进一步，我们把目光聚焦在糖酵解，设计合成了芹菜素活性探针，并利用化学蛋白质组学技术，发现了芹菜素直接作用的6个糖酵解通路关键靶标蛋白，即HK1、LDHA、MARS1、ACOT7、GSTO1、KPNA2。我们通过RNA干扰技术对靶标进行基因敲低后再给予芹菜素进行药效检测，其结果发现芹菜素抑制A549细胞的关键靶标为HK1 （己糖激酶1 ），并借助Pull-down实验证实了芹菜素与HK1的相互作用。最后，动物层面的结果也验证了5-10 mg/kg芹菜素具有体内抗肺癌活性，并可改善乌拉坦诱导的肺癌小鼠的生长情况和肺组织状态。 结论：根据以上实验结果，芹菜素在低氧条件下通过抑制HK1调控糖酵解，诱导细胞凋亡途径，从而发挥对A549细胞的抑制作用。
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