摘要
目的： 观察党参多糖（CPPs）对去卵巢大鼠骨质疏松的影响，研究 CPPs 在骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨/成脂分化中的作用，探讨CPPs对H2O2致小鼠成骨前体细胞（MC3T3-E1）氧化损伤的影响及机制。 方法： 1．观察 CPPs对去卵巢大鼠骨质疏松的影响，采用双侧去卵巢（OVX）手术构建骨质疏松（OP）大鼠模型，48只 12周龄的 SPF级雌性 SD大鼠分为：假手术组（Sham）、去卵巢组（OVX）、雌二醇组（E2，OVX+50 ?g/kg/d 雌二醇）、CPPs 低剂量组（ CPPs-L ， OVX+100 mg/kg/d CPPs ）、CPPs 中剂量组（ CPPs-M ， OVX+200 mg/kg/d CPPs ）、CPPs 高剂量组（ CPPs-H ， OVX+400 mg/kg/d CPPs），干预12周后收集标本。采用酶联免疫法吸附试验（ELISA）测定血清生化指标；苏木精-伊红（Hamp;E）染色检测肝脏、肾脏、股骨远端组织形态学；微计算机断层扫描技术（Micro-CT）观察股骨微结构，测定骨小梁骨矿物质密度（BMD）及骨小梁相关参数，如骨组织体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁分离度（Tb.Sp）；抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）检测股骨中破骨细胞数量；免疫组织化学（IHC）法检测股骨中 Runt 相关转录因 2（Runx2）、β-catenin、Pumilio 2（PUM2）的蛋白表达。 2．CPPs对大鼠 BMSCs成骨/成脂分化的作用及对 Wnt/β-catenin信号通路的影响。全骨髓贴壁法提取 SD 大鼠的 BMSCs，流式细胞术鉴定 BMSCs 表型。 （1）不同浓度 CPPs（0、25、50、100 ?g/mL）干预 BMSCs，检测各组BMSCs的成骨、成脂分化相关指标，以及β-catenin的表达情况。 （2）加入Wnt/β-catenin信号通路抑制剂 DKK1，将 BMSCs分为对照组、CPPs 组（100 ?g/mL）、CPPs+DKK1（100 ?g/mL CPPs + 500 ng/mL DKK1）组，检测各组BMSCs的成骨、成脂分化相关指标。 采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）法检测成骨、成脂分化相关因子的 mRNA 表达；采用蛋白免疫印迹试验（WB）法检测成骨、成脂分化相关因子的蛋白表达；给予成骨分化诱导液培养 14、28天，分别采用碱性磷酸酶（ALP）染色法、茜素红染色（ARS）法，观察各组 BMSCs 的 ALP 活性及矿化结节；给予成脂分化诱导液培养 21天，采用油红 O染色（ORO），观察成脂分化；采用 WB和细胞免疫荧光法检测 β-catenin在 BMSCs中的蛋白表达。 3．CPPs对H2O2致氧化损伤下MC3T3-E1细胞功能的影响。检测不同浓度H2O2及 CPPs干预 MC3T3-E1细胞不同时间对细胞增殖的影响，筛选实验用浓度及时间。 （1）观察 CPPs 对 H2O2致 MC3T3-E1 细胞氧化损伤及线粒体自噬的影响：①将 MC3T3-E1 细胞分为对照组、H2O2（200 ?M）组、H2O2+CPPs（200?M H2O2 + 25、50、100 ?g/mL CPPs）组，检测各组细胞的增殖、成骨分化、凋亡、ROS 及线粒体自噬相关蛋白的表达。②加入粒体自噬抑制剂环孢素 A （ CsA ），将 MC3T3-E1 细胞分为对照组、H2O2 （ 200 ?M ）组、H2O2+CPPs （200?M H2O2+100?g/mL CPPs）组、H2O2+CPPs+CsA（200?M H2O2+100?g/mL CPPs+0.4?M CsA）组，检测各组细胞的成骨分化、凋亡、细胞内ROS水平及线粒体自噬水平。 （2）观察 CPPs 对 H2O2致 MC3T3-E1 细胞氧化损伤过程中 PUM2 的影响，以及 PUM2 在 CPPs 保护成骨细胞氧化损伤中的作用：①检测不同浓度H2O2（0、50、100、200、400 ?M）作用下MC3T3-E1细胞PUM2的mRNA及蛋白表达。②采用质粒转染过表达 MC3T3-E1 细胞中的 PUM2，将 MC3T3-E1细胞分为对照组（ NC 组）、阴性质粒组（ pEx-NC ）、PUM2 质粒组（ pEx-PUM2），检测各组细胞的成骨分化相关因子的蛋白表达、细胞内ROS水平及线粒体自噬相关因子的表达。③将 MC3T3-E1 细胞分为对照组（NC 组）、H2O2 （ 200 ?M ）组、H2O2+CPPs （ 200 ?M H2O2 + 100 ?g/mL CPPs ）组、H2O2+CPPs+pEx-PUM2（200?M H2O2+100?g/mL CPPs+pEx-PUM2）组，检测各组细胞的成骨分化功能、细胞内ROS水平、线粒体自噬相关因子的表达。 采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测细胞增殖；WB法检测成骨分化相关因子（ COL I、Runx2 ）、自噬相关因子（ LC3、P62 ）以及凋亡相关因子（Caspase-9、Caspase-3、Bax、Bcl-2）的蛋白表达；采用 ALP、ARS染色法分别检测 ALP活性及矿化结节形成情况；流式细胞术检测细胞凋亡；流式细胞术结合荧光显微镜检测细胞内 ROS水平；免疫荧光法结合荧光显微镜观察细胞内PUM2蛋白表达情况。 结果： 1．体内实验显示，与Sham组相比，OVX组骨皮质变薄、骨小梁结构变稀疏、骨髓腔内大量空泡，BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th 显著下降（P＜0.05）， Tb.Sp显著增加（P＜0.05），TRAP染色面积明显增加；与 OVX组相比，E2组和CPPs-L组、CPPs-M组、CPPs-H组骨皮质变厚、骨小梁结构变紧密、骨髓腔内空泡减少，BMD、BV/TV、Tb.N 也显著增加（P＜0.05），Tb.Sp 显著下降（P＜0.05），TRAP 染色面积明显减少。E2 组以上指标与 Sham 组之间没有显著差异。与 Sham 组相比，OVX 组股骨 Runx2、β-catenin 表达下降（均 P＜0.05），PUM2 表达升高（P＜0.05）；与 OVX 组相比，E2 组和 CPPs-L 组、CPPs-M组、CPPs-H组 Runx2、β-catenin表达升高（均 P＜0.05），PUM2表达下降（P＜0.05）。 2．CPPs对大鼠BMSCs成骨/成脂分化的影响。 成功提取大鼠 BMSCs，流式细胞术鉴定 BMSCs表面抗原 CD29、CD90、CD34、CD45的阳性率分别为96.62%、98.78%、0.27%、0.28%。 （ 1 ）与对照组相比， CPPs （ 25、50、100 ?g/mL ）干预，显著增加了BMSCs 成骨分化相关因子（Runx2、COL I、ALP、OPN）的 mRNA 及蛋白表达（P＜0.05）、ALP活性及矿化结节形成；显著抑制了BMSCs成脂分化相关因子（PPAR-γ、C/EBP-α）的mRNA及蛋白表达（P＜0.05）、脂滴形成。 （2）加入 Wnt/β-catenin 信号通路抑制剂 DKK1 后，与 CPPs 组比较， CPPs+DKK1组成骨分化相关因子（Runx2、COL I、ALP、OPN）的 mRNA及蛋白表达显著下降（均 P?0.05）、ALP 活性及矿化结节形成减少，而成脂分化相关因子（PPAR-γ、C/EBP-α）的 mRNA及蛋白表达显著增加（均 P＜0.05）、脂滴形成增加。 3．CPPs对H2O2致氧化损伤下MC3T3-E1细胞功能的影响。 （1）CPPs通过增加线粒体自噬减轻H2O2对MC3T3-E1细胞的氧化损伤。 结论： 1．党参多糖减轻去卵巢导致的大鼠骨质疏松，骨皮质增厚、骨小梁结构紧密、骨髓腔内空泡减少、BMD、BV/TV、Tb.N 显著增加，且无肝肾损伤及血糖、血脂代谢紊乱。 2．党参多糖缓解去卵巢导致的大鼠骨质疏松的机制可能与其增加骨组织内Runx2、β-catenin表达，降低PUM2表达有关。 3．党参多糖通过增加 BMSCs内 β-catenin表达促进 BMSCs向成骨细胞分化。 4．党参多糖通过抑制 PUM2过表达和增加自噬水平减轻 H2O2致 MC3T3-E1细胞的氧化损伤，抑制细胞的凋亡，促进细胞的成骨分化。
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