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亚洲镰孢菌与禾谷镰孢菌对琥珀酸脱氢酶抑制剂敏感性差异的分子机制
陈稳产1
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摘要
由禾谷镰孢菌复合种（Fusarium graminearum species complex）引起的小麦赤霉病（Fusarium head blight）是禾谷类作物上的一种毁灭性病害，在全球小麦种植区都有发生。亚洲镰孢菌（F. asiaticum）和禾谷镰孢菌（F. graminearum）是引起我国小麦赤霉病的主要致病菌。由先正达公司创制的氟唑菌酰羟胺（Pydiflumetofen）是目前唯一登记在防治小麦赤霉病的琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂（Succinate dehydrogenase inhibitors，SDHIs），该药不仅对小麦赤霉病具有优异的防效，还能显著降低小麦籽粒中呕吐毒素（Deoxynivalenol，DON）的含量。实验室的前期研究结果表明，尽管这两种镰孢菌在遗传学上的亲缘关系和核基因组均非常接近，但是它们对SDHIs的敏感性存在显著差异。禾谷镰孢菌对SDHIs的敏感性显著高于亚洲镰孢菌。因此，立题研究了导致小麦赤霉病的两种镰孢菌间对SDHIs的敏感性差异的分子机制，为开发反抗性的SDHIs药剂、科学指导用药和延缓田间抗性形成具有重要意义。主要研究结果如下： （1）评价亚洲镰孢菌对氟唑菌酰羟胺的抗性风险。以亚洲镰孢菌测序菌株2021为出发菌株，通过室内药剂驯化，共获得5株对氟唑菌酰羟胺的抗性突变体，突变频率为0.5%。测序结果表明，在抗性突变体中存在 FaSdhBH248Y、FaSdhC1A64V和FaSdhC1R67K三种突变基因型。通过构建替换突变体，证实了FaSdhBH248Y导致亚洲镰孢菌对氟唑菌酰羟胺的中抗，而FaSdhC1A64V或FaSdhC1R67K均可导致该菌对氟唑菌酰羟胺的高抗。进一步研究表明：抗性突变体的适合度均与敏感菌株无显著差异；三种抗性突变体的 SDH酶活性及 ATP含量均显著高于出发菌株2021；FaSdhBH248Y、FaSdhC1A64V和FaSdhC1R67K替换突变体对SDHIs药剂具有不同的交互抗性模式；在5μg/mL氟唑菌酰羟胺处理条件下，出发菌株2021、FaSdhBH248Y、FaSdhC1A64V和FaSdhC1R67K替换突变体 FaSdhC1的相对表达量较无药处理分别上调了967.74、239.30、138.29和517.53倍，而FaSdhA、FaSdhB、FaSdhC2和FaSdhD的相对表达量变化在0.78-14.04倍之间，即在5μg/mL氟唑菌酰羟胺处理下，与敏感菌株2021相比，FaSdhBH248Y、FaSdhC1A64V和FaSdhC1R67K替换突变体FaSdhC1相对表达量分别下调了1.70、2.84和2.49倍。以上结果表明，亚洲镰孢菌对氟唑菌酰羟胺存在中~高水平的抗性风险。 （2）研究亚洲镰孢菌FaSdh在调控亚洲镰孢菌对SDHIs敏感性的作用。本研究构建了FaSdhA、FaSdhB、FaSdhC1、FaSdhC2和FaSdhD的缺失突变体、回补突变体和GFP/RFP荧光标记突变体。研究结果表明：FaSdhA、FaSdhB、FaSdhC1、FaSdhC2和FaSdhD均定位于线粒体；ΔFaSdhA、ΔFaSdhB和ΔFaSdhD的菌丝生长严重受损，而ΔFaSdhC1和ΔFaSdhC2的菌丝生长速率、产孢能力、产毒能力、致病力、SDH酶活性及ATP含量均显著下降；ΔFaSdhC1和ΔFaSdhC2对非发酵碳源的利用能力显著增强，而对可发酵碳源的利用能力显著下降；ΔFaSdhC1对氧化胁迫的敏感性显著降低，而ΔFaSdhC2对氧化胁迫的敏感性显著升高，两缺失突变体对渗透压胁迫的敏感性均显著降低；ΔFaSdhC1对 SDHIs均表现为超敏感，而ΔFaSdhC2对啶酰菌胺、氟唑菌酰羟胺和Y12196的敏感性显著降低，对氟苯醚酰胺和噻呋酰胺的敏感性显著升高；经5μg/mL氟唑菌酰羟胺处理24 h，出发菌株2021的FaSdhA、FaSdhB、FaSdhC2和FaSdhD的相对表达量较无药处理分别升高了14.00、10.93、14.41和6.55倍，而FaSdhC1相对表达量较无药处理升高了967.74倍；出发菌株2021的分生孢子、幼殖体和次生菌丝的 FaSdhC1荧光强度在5μg/mL氟唑菌酰羟胺处理24 h后显著强于无药处理下FaSdhC1的荧光强度，而另外四个亚基的荧光强度均无显著变化。上述结果表明，亚洲镰孢菌FaSdhC1和FaSdhC2在调控菌体对SDHIs敏感性作用中存在功能分化。 （3）评价禾谷镰孢菌对氟苯醚酰胺的抗性风险。以禾谷镰孢菌PH-1为出发菌株，通过室内药剂驯化共获得4株对氟苯醚酰胺抗性突变体，突变频率为0.4%。序列比对发现，抗性突变体存在三种突变类型：距FgSdhC1转录起始位点（ATG）前-57bp处的碱基A突变成T（FgSdhC1Pro）、FgSdhC2T77I或FgSdhC2R86C。通过构建上述三种替换突变体，证实了 FgSdhC1Pro导致禾谷镰孢菌对氟苯醚酰胺具有高水平抗性，而FgSdhC2T77I或 FgSdhC2R86C点突变均可导致其对氟苯醚酰胺的低水平抗性。三种抗性替换突变体的适合度均显著下降；FgSdhC1Pro替换突变体的SDH酶活性和ATP含量较出发菌株PH-1均无显著变化，而FgSdhC2T77I和FgSdhC2R86C替换突变体的SDH酶活性和 ATP含量均显著下降；三种抗性替换突变体对氧化胁迫敏感性显著降低，仅FgSdhC2T77I和FgSdhC2R86C替换突变体对渗透压胁迫的敏感性显著升高；FgSdhC1Pro、FgSdhC2T77I和 FgSdhC2R86C替换突变体对 SDHIs具有不同的交互抗性模式；在10μg/mL氟苯醚酰胺处理条件下，出发菌株PH-1、FgSdhC1Pro、FgSdhC2T77I和FgSdhC2R86C替换突变体FgSdhC1相对表达量分别较无药处理升高了84.28、64.03、52.12和107.27倍，而FgSdhA、FgSdhB、FgSdhC2和FgSdhD相对表达量变化在0.39-3.78倍之间，即在10μg/mL氟苯醚酰胺处理下，FgSdhC1Pro和FgSdhC2T77I替换突变体FgSdhC1相对表达量显著降低0.74和0.23倍，而FgSdhC2R86C替换突变体FgSdhC1相对表达量无显著变化。以上结果表明，禾谷镰孢菌对氟苯醚酰胺存在中等水平的抗性风险。 （4）研究 FgSdh在调控禾谷镰孢菌对 SDHIs敏感性的作用。本研究构建了FgSdhA、FgSdhB、FgSdhC1、FgSdhC2和FgSdhD的缺失突变体、回补突变体和GFP/RFP荧光标记突变体。研究结果表明：FgSdhA、FgSdhB、FgSdhC1、FgSdhC2和 FgSdhD均定位于线粒体；ΔFgSdhC1的菌丝生长速率、产孢能力、产毒能力、致病力、SDH酶活性及ATP含量均显著下降；FgSdhA、FgSdhB或FgSdhD的缺失导致菌丝生长严重受阻，而 FgSdhC2无法被敲除；ΔFgSdhC1对氧化胁迫的敏感性显著降低，对渗透压胁迫的敏感性无显著变化；ΔFgSdhC1对非发酵碳源柠檬酸钠和乙酸钠的利用能力均显著降低，对可发酵碳源葡萄糖的利用能力显著升高；ΔFgSdhC1对氟苯醚酰胺、噻呋酰胺和Y12196的敏感性显著增加，但对氟唑菌酰羟胺和啶酰菌胺的敏感性显著降低；经5μg/mL氟唑菌酰羟胺处理24 h，出发菌株PH-1的FgSdhC1相对表达量较无药处理升高了659.38倍，而FgSdhA、FgSdhB、FgSdhC2和FgSdhD的相对表达量分别升高了15.08、17.05、11.66和5.47倍；经5μg/mL氟唑菌酰羟胺处理24 h，出发菌株PH-1的分生孢子、幼殖体和次生菌丝的FgSdhC1荧光强度较无药处理下均无显著变化。结果表明，FgSdhC1在调控禾谷镰孢菌的营养生长、无性繁殖、致病力和对SDHIs敏感性中发挥重要作用。 （5）研究亚洲镰孢菌与禾谷镰孢菌对SDHIs敏感性差异的分子机制。尽管亚洲镰孢菌与禾谷镰孢菌的核基因组相似度非常高，但两菌对SDHIs的敏感性却存在显著差异。亚洲镰孢菌 FaSdhA、FaSdhB、FaSdhC1、FaSdhC2和 FaSdhD与禾谷镰孢菌FgSdhA、FgSdhB、FgSdhC1、FgSdhC2和FgSdhD的氨基酸序列同源率分别是95.23%、100%、92.30%、98.93%和98.90%。FaSdhA与FgSdhA共存在49个差异氨基酸，其中FaSdhA的N端比后者多15个氨基酸；FaSdhC2与FgSdhC2存在2个差异氨基酸， FaSdhD与FgSdhD存在2个差异氨基酸；FaSdhC1与FgSdhC1共存在26个差异氨基酸，其中FaSdhC1的N端比后者少14个氨基酸。FaSdhC1与 FgSdhC1存在的12个差异氨基酸可分为两类：（1）靠近FgSdhC1与FaSdhC1蛋白的N端有4个差异氨基酸，（2）靠近FgSdhC1与FaSdhC1蛋白的C端有8个差异氨基酸。
关键词
小麦赤霉病/亚洲镰孢菌/禾谷镰孢菌/琥珀酸脱氢酶抑制剂/敏感性/FaSdhC1基因/FgSdhC1基因引用本文复制引用
授予学位
博士学科专业
植物保护;农药学导师
陈长军学位年度
2021学位授予单位
南京农业大学语种
中文中图分类号
S4