摘要
烟草是重要的叶用经济作物，但叶斑病害的发生严重制约着烟草的生产。由多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）引起的烟草棒孢霉叶斑病是一种真菌病害，且近几年该病害在广西烟草生产上的危害有加重趋势，目前针对广西烟草棒孢霉叶斑病的研究报道仍然较少。本研究通过对从广西贺州、百色、河池等主要烟区采集的病叶标本进行病原菌分离鉴定、病原菌毒素蛋白亚型检测、致病性测定、室内毒力测定、田间防治药剂筛选、病原菌全基因组测定等试验，以期明确广西烟草棒孢霉叶斑病病原菌的种类、毒素蛋白亚型及Cas7毒素亚型病原菌基因组信息，并筛选出优良杀菌剂，为科学防治广西烟草棒孢霉叶斑病提供理论基础。取得的主要研究结果如下： 1.对采自广西烟区的烟草叶斑病叶片进行病原菌分离、纯化，根据柯赫氏法则对其进行致病性测定，通过形态学鉴定，再利用核糖体转录间隔区（ITS）、翻译延伸因子（EF-1α）、β微管蛋白（TUB）等基因片段进行分子鉴定。结果显示，分离纯化得到的 15 株病原菌均对烟草致病，病原菌在PDA培养基上的菌落正面为青灰色，菌丝紧密呈绒毛状，菌落边缘呈灰白色；孢子淡褐色，呈棒状，一端略细；分子测序结果与 GenBank 里的多主棒孢霉具有99%及以上的同源性。通过3基因片段串联构建系统发育树，本研究中病原菌与多主棒孢霉聚于一个分支上，基于形态学和分子生物学分析结果，将广西烟草棒孢霉叶斑病的病原菌鉴定为多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）。 2.利用毒素蛋白基因的特异性引物和对多种植物的致病性进行毒素亚型测定，首次鉴定、分析广西烟草棒孢霉病菌的毒素蛋白亚型。结果显示，在广西烟草棒孢霉叶斑病15个分离菌株中，14个菌株的毒素蛋白亚型为Cas0，1个菌株的毒素蛋白亚型为Cas7，表明Cas0基因亚型较多，且在靖西市同德乡首次发现烟草棒孢霉病菌中的Cas7毒素蛋白基因。致病性测定结果表明，两种不同毒素亚型的病原菌对烟草（K326）、橡胶（海垦 6 号和海垦 1号）、黄瓜、苦瓜、番茄等作物均有致病性，对香蕉（金粉1号和桂蕉6号）均无致病性。 3.采用菌丝生长速率法测定了12种杀菌剂对采自广西贺州、百色、河池3个烟区8株烟草棒孢霉病菌菌株生物活性的影响，扩增并分析了多主棒孢霉菌细胞色素b基因（Cytb）部分序列，以期探寻该病原菌对QoIs类的2种杀菌剂敏感性下降的分子机制。结果表明，供试杀菌剂对烟草棒孢霉病菌菌丝生长均有不同程度的抑制，抑菌效果比较好的是咪鲜胺、氟啶胺和吡噻菌胺，EC50值分别为0.049±0.027、0.063±0.045、0.286±0.077 mg/L。该菌群体对QoIs类杀菌剂产生很高的耐药性，但经实验发现多主棒孢霉菌与抗性相关的位点未出现Cytb基因突变。选取室内毒力测定中抑菌效果好的4种杀菌剂和市面上推广的2种微生物菌剂进行田间防治试验，结果表明，供试药剂对该病害均有不同程度的防治效果，其中吡噻菌胺的防治效果较好，其次为氟吡菌酰胺、氟啶胺和咪鲜胺。 4.为深入了解 Cas7 毒素亚型的多主棒孢霉，本研究通过第二代、第三代测序技术对从广西烟草棒孢霉叶斑病上分离的Cas7毒素亚型多主棒孢霉菌株CBJT进行全基因组测序、组装和预测注释。组装完成的基因组大小为43.88 Mb，包含了171个Scaffolds，其N50为1.68 Mb，GC含量为51%。总共预测了14172个基因，39644个外显子，14135个启动子， 14109个终止子，重复区域长度为2.94 Mb，重复碱基所占比率为6.70%。确定了Cas7基因序列对应全基因组序列中第46个Scaffolds的第48951-49424位，明确Cas7基因所处位置，可为后续研究上下游调控及影响因素奠定基础。以上信息可为后续研究多主棒孢霉的重要基因功能分析和科学防治烟草棒孢霉叶斑病提供数据基础。
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