摘要
自2016年以来，中国江苏、安徽、山东、河南、四川、广东等多个地区养鹅场暴发了新型鹅星状病毒（Goose astrovirus，GAstV）引起雏鹅痛风的传染病，对我国养鹅业造成巨大经济损失。该病主发于20日龄以下的雏鹅，在鹅群中既可水平传播又能垂直传播，感染率高，死亡率约2%-50%，死亡雏鹅胸腹膜及内脏表面、关节腔、输尿管中有大量白色尿酸盐沉积，肾脏因尿酸盐沉着和严重肿胀而呈花斑状，目前还没有有效控制该疾病的药物与疫苗。 本实验室和其他学者先前研究结果显示肾脏是新型鹅星状病毒侵害的主要靶器官，病死雏鹅除痛风外主要病变为肾脏苍白肿胀，且所有组织中肾脏病毒载量最高。为了解雏鹅感染新型鹅星状病毒后肾脏病理损伤的变化规律，将100只1日龄健康雏鹅随机分为实验组与对照组两组，每组50只，实验组每只口服0.5 mL GAstV病毒液，对照组每只口服0.5 mL PBS，于感染后12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d、11 d、15 d、19 d（dpi）观察临床症状并每组剖杀5只雏鹅，采取血液和肾脏组织并称重，用荧光定量PCR方法检测血清和肾脏中病毒载量，微板法检测血清中尿酸和肌酐的含量；HE染色、Masson、PAS染色和电子透射显微镜观察肾组织病理学变化；免疫组织化学观察病毒在肾脏的定位。试验结果表明雏鹅感染GAstV后生长缓慢，体重从7dpi起相较于对照组明显下降（Plt;0.05）。血清和肾脏中病毒载量均在3 dpi时骤然升高，分别在3 dpi和7 dpi达到高峰后逐渐下降。血清中尿酸和肌酐含量在3 dpi、5 dpi、7 dpi均显著高于对照组（Plt;0.05）。肉眼观察雏鹅肾脏，与对照组相比，实验组于感染3天后出现苍白肿胀，肾脏相对重量明显增加（Plt;0.05），组织病理学检查发现感染雏鹅肾小管上皮细胞在3 dpi开始出现病理损伤，可见其变性、坏死，近曲小管刷状缘结构受损，肾小球的血管球系膜在7 dpi、11 dpi、15 dpi增厚，肾间质于5 dpi、7 dpi、11 dpi伴有炎性细胞浸润，在7 dpi、11 dpi可见纤维化。电镜观察发现攻毒后雏鹅肾脏细胞核核膜增厚，线粒体肿胀、大量线粒体脊断裂，胞浆中可见自噬小体和自噬溶酶体的结构。免疫组化结果表明GAstV主要存于肾小管上皮细胞胞浆内。 为进一步探究GAstV对肾脏造成损伤的机制，本课题组收集感染3 d、5 d、7 d、11 d、15 d后的实验组与对照组雏鹅肾脏，用微板法检测氧化损伤相关指标SOD、MDA、GSH-PX、T-AOC活性；Tunel法检测肾脏细胞凋亡率；qRT-PCR检测自噬相关基因LC3B、Beclin1、ATG5，细胞间连接关键基因ZO-1、Occludin、claudin-10，α-catenin、β-catenin、catenin-α2，肾小球足细胞损伤相关基因WT1、desmin，细胞因子iNOS、TNF-α、IL-8、IL-1β和禽类肾脏中重要的尿酸转运蛋白MRP4在mRNA水平上的变化；Western Blot对自噬相关基因LC3Ⅱ、Beclin1和泛素结合蛋白P62以及尿酸转运蛋白MRP4在蛋白水平上的表达进行定量分析；免疫组化方法对LC3B、Beclin1、P62在肾脏中进行定位。结果显示与对照组相比，感染组肾脏仅在7 dpi时SOD活力值明显下降，MDA含量明显升高（Plt;0.05）；细胞凋亡率在3 dpi、7 dpi、11 dpi均与对照组无明显差异（Pgt;0.05）；自噬相关基因LC3B、Beclin1在5 dpi、7 dpi、11 dpi mRNA表达明显升高，ATG5在5 dpi、7 dpi mRNA表达上调（Plt;0.05），LC3Ⅱ和Beclin1蛋白表达在5 dpi、7 dpi、11 dpi 显著增加（Plt;0.05），P62蛋白表达明显下降（Plt;0.05），且LC3B、Beclin1、P62均主要存在于肾小管上皮细胞中；细胞间连接关键基因ZO-1和Occludin分别在3 dpi表达明显下降，而后恢复至正常水平， claudin-10在3 dpi至15 dpi表达均显著降低，α-catenin和β-catenin和catenin-α2表达在5 dpi和7 dpi时明显上升（Plt;0.05）；肾小球足细胞损伤相关基因desmin在7 dpi、11 dpi表达升高，而WT1在感染前期下调，于7 dpi时明显增加（Plt;0.05）；细胞因子TNF-α、iNOS和IL-8在5 dpi、7 dpi、11 dpi显著上调，而IL-1β仅在7 dpi时上升，在其他时间点明显下降（Plt;0.05）；尿酸转运蛋白MRP4在3 dpi至15 dpi mRNA和蛋白表达均明显降低（Plt;0.05）。 以上结果表明，GAstV感染雏鹅后引起肾小管上皮细胞变性、坏死和自噬，并导致紧密连接在感染前期遭受破坏，肾小球足细胞受损，血管球系膜增厚，肾间质纤维化以及促炎性因子的大量生成，进而影响肾脏的正常结构与功能代谢，尿酸排泄能力下降，促进了雏鹅体内痛风的发生。
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