摘要
目的: 1.通过理清温疫病的相关理论概念，理顺疫病的分类、诊治思路，探讨新型冠状病毒感染(COVID-19)的中医理论内涵，分析其病因病机。以湿毒疫立论，并以冠宁汤为例，探讨COVID-19中医药治疗思路，结合现代研究，分析中医治疗COVID-19的可能机制。 2.回顾性分析冠宁汤治疗COVID-19的临床病例，评价其疗效。 3.利用现代信息学技术及实验技术探讨冠宁汤的治疗靶点及通路。通过急性肺损伤模型对冠宁汤经由MAPK/JNK通路抑制中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的形成减轻炎性反应的机制进行论治。 方法: 1.理论研究 (1)阅读古籍及文献，梳理温病学理论的形成及发展，对温病的发展、现代内涵及分类进行回顾学习，理顺疫病的概念及分类，分析湿毒疫的证治。 (2)结合温病理论探讨COVID-19因机证治，结合团队前期团队的研究及现代文献，尝试用现代理论解释中医药治疗COVID-19的机制。 2.临床研究 (1)纳入武汉市第三医院和湖北省中医院共计231例于2020年1月27日至2020年3月18日入院的COVID-19患者，根据患者的治疗方案分为干预1组(冠宁汤组)83例，干预2组(清肺排毒汤组)101例，西药组47例。分析患者的性别、年龄、有无基础疾病、核酸是否阳性等一般情况，归纳总结患者的疾病初起症状，肺部CT表现，以便以证索因。 (2)分析三组患者平均住院时间、观察期内转ICU治疗率、并发症及机械通气发生率、治愈率、好转率、死亡率、核酸转阴时间、CT转归、症状改善及实验室指标变化情况，分析中西医结合和西药治疗之间的临床结局差异情况。 3.实验研究 (1)成分鉴定及靶点预测:利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术对冠宁汤汤剂的部分成分进行鉴定，利用信息学技术，对冠宁汤的作用靶点及通路进行富集，预测冠宁汤的现代作用机制。 (2)抗炎保护作用研究:脂多糖(LPS)雾化构建小鼠急性肺损伤(ALI)模型，将56只小鼠随机分成空白组(Contro1)、模型组(Mode1)、甲泼尼龙组(MPN)、冠宁汤等剂量组(GNT)、冠宁汤高剂量组(GNTH)、冠宁汤等剂量+甲泼尼龙组(GNT+MPN)、冠宁汤高剂量+甲泼尼龙组(GNTH+MPN),每组8只，雌雄各4只。药物干预3天后灌胃造模，造模后1小时灌胃1次。末次灌胃后禁食禁水7小时后取材。通过病理切片HE染色观察肺组织局部改变及炎性浸润情况。观察小鼠相关炎症指标，ELISA检测肺泡灌洗液(BALF)中IL-1β、IL-6、TNF-α,血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平，qPCR检测肺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平;探索冠宁汤ALI小鼠的抗炎保护作用。 (3)作用通路研究:脂多糖(LPS)雾化构建小鼠急性肺损伤(ALI)模型，将48只小鼠随机分成空白组(Contro1)、模型组(Mode1)、甲泼尼龙组(MPN)、冠宁汤等剂量组(GNT)、GSK484组(PAD4抑制剂组)、SP600125组(JNK通路抑制剂组)，每组8只，雌雄各4只。空白组及模型组给予生理盐水，按0.01ml/g灌胃，冠宁汤等剂量组用标准液稀释一倍后按0.01ml/g灌胃，甲泼尼龙组药物按0.01ml/g分别灌胃，SP600125组按0.01ml/g尾静脉注射，GSK484组按0.01ml/g腹腔注射。连续用药3天,每日一次。第3天用药1小时后开始造模。造模结束后1小时各组再用药一次。末次给药后，所有小鼠禁食禁水7小时，处死小鼠取材。显微镜下观察小鼠肺部HE染色病理切片，观察病理切片中NETs形成情况(炎性细胞浸润情况);观察小鼠NETs相关指标:ELISA检测肺泡灌洗液、血清、肺组织中NE、MPO水平;探索冠宁汤ALI小鼠的抗炎保护作用;免疫荧光染色，测MPO,计算MPO细胞的比率评分，衡量组织中NETosis的程度;免疫印迹法测PAD4、JNK、p-JNK水平，观察冠宁汤对通路的作用情况。 结果: 1.理论探讨结果 (1)温疫不是某一种具体的疾病，凡是具有起病急骤、传变迅速、病情凶险、较强传染性、广泛流行性的温病均可称为温疫。温疫为感受疫疠毒邪而发，与温病在本质上并无区别。当温病发生了较大范围的流行就可称之为温疫。因此温疫较一般温病而言，没有明显季节性。 (2)COVID-19无论是何种中医命名，大多数命名均体现了该病的特点与“湿”有关。本课题组认为其主要病性为湿热毒邪，亦可称之为湿热疫毒，早期“湿、毒”，进而出现“瘀、闭”，病位以肺脾为主，涉及多个脏器。治疗以分消湿热疫毒、宣畅气机为主，要早诊断，重驱邪，防传变。 (3)COVID-19可导致ALI。NETs可能参与ALI的过度炎症反应,并与COVID-19的预后不良有关。中药治疗可以改善疾病预后。 2.临床研究结果 (1)冠宁汤可减轻患者的临床症状，改善患者的实验室指标，使HGB、LYM、ALB 较前上升，NLR、AST、CK、CRP、LDH、PLR 较前下降。 (2)冠宁汤组有更低的转ICU治疗率，也有更低的出现并发症及机械通气的概率。 3.实验研究结果 (1)冠宁汤汤剂鉴定出左旋咪唑、甘氨酸、甜菜碱、柠檬酸盐、葡萄糖酸、脯氨酸、远志咕吨酮、甘草皂苷H2、L-胆碱、黄酮醇、苦杏仁苷、DL-3-苯基乳酸、知母皂苷BII、菪烷、异亮氨酸、苯丙酮酸、丝兰糖甙C、呋甾皂苷、新皂甙元3-[葡萄糖基-(1-＞2)-葡萄糖基-(1-＞4)-半乳糖苷]、1-(4-羟基-2-甲氧基苯基)-乙酮、黄芩黄酮Ⅱ、缬氨酸、3-羟基香豆素等多种有效成分，这些成分可参与抗炎、代谢等多种生物功能。用网络药理学查找冠宁汤成分及靶点，GO功能分析及KEGG通路分析，冠宁汤在MAPK通路及蛋白上的富集排序，结合冠宁汤临床研究，其可以降低炎症指标，具有抗炎效果，可选定MAPK通路上的相关蛋白进行冠宁汤的机制研究。冠宁汤作用靶点JUN、CASP3、MAPK3、MAPK1、MAPK14、TNF、AKT1、STAT3等34个在这条通路。MAPK和基因表达调控及细胞质功能活动有关，冠宁汤作用前10基因与MAPK通路密切相关。尤其是MAPK3、AKT1、JUN均与MAPK通路上JNK关系紧密，以此我们推测冠宁汤得作用通路可能是MAPK/JNK。 (2)抗炎机制研究结果:病理切片HE染色后，200倍显微镜镜下观察。Control组肺组织整体结构基本正常，肺泡结构清晰，未见肺泡萎缩扩张等变性，肺泡上皮细胞未见明显脱落坏死，肺间质未见明显充血扩张,肺泡腔未见明显炎症细胞浸润。Model组肺组织整体结构异常，可见大量肺泡萎缩塌陷、肺泡壁明显增厚，大面积实质化，肺间质未见血管明显充血扩张，肺泡腔可见明显炎症细胞浸润。GNT组肺组织整体结构异常，可见大量肺泡萎缩塌陷、肺泡壁明显增厚，局部实质化，肺间质未见血管明显充血扩张，肺泡腔可见少量炎症细胞浸润。GNTH组肺组织整体结构异常，未见肺泡融合扩张萎缩等变性，可见部分肺泡上皮细胞脱落，少量肺泡壁轻微增厚，肺泡腔可见少量炎症细胞浸润。MPN组肺组织整体结构异常，未见肺泡融合扩张萎缩等变性，可见少量肺泡壁轻微增厚，肺泡腔可见明显炎症细胞浸润。GNT+MPN组肺组织整体结构轻度异常，未见肺泡融合扩张萎缩等变性，肺泡壁未见明显增厚，肺泡腔可见明显炎症细胞浸润。GNTH+MPN组肺组织整体结构轻度异常，未见肺泡融合扩张萎缩等变性，肺泡壁未见明显增厚，肺泡腔可见明显炎症细胞浸润。 (3)作用通路结果:200倍显微镜镜下HE病理切片。Control组肺组织整体结构基本正常，肺泡结构清晰，未见肺泡萎缩扩张等变性，肺泡上皮细胞未见明显脱落坏死，肺间质未见明显充血扩张，肺泡腔未见明显炎症细胞浸润。GNT组肺组织整体结构异常，未见肺泡融合扩张萎缩等变性，可见部分肺泡壁明显增厚，轻微实质化，肺间质未见血管充血扩张,肺泡腔可见少量炎症细胞浸润;而MPN组可见明显炎症细胞浸润。PAD4抑制剂组肺组织整体结构轻度异常，未见肺泡融合扩张萎缩等变性，肺泡壁未见明显增厚，肺间质未见血管明显充血扩张，肺泡腔可见明显炎症细胞浸润。SP600125组肺组织整体结构基本正常，肺泡结构清晰，未见肺泡萎缩扩张等变性，肺泡上皮细胞未见明显脱落坏死，肺间质未见明显充血扩张，肺泡腔可见少量炎症细胞浸润。 结论: 1.结合COVID-19患者的临床表现，以证测因，患者病因为湿热毒邪,亦可称之为湿热疫毒，早期“湿、毒”为患，进而出现“瘀、闭”之象，病位以肺脾为主，涉及多个脏器。COVID-19属于湿毒疫，治疗以分消湿热疫毒、宣畅气机为主，要早诊断，重驱邪，防传变。 2.中药可以改善患者的临床症状、体征，冠宁汤治疗可以改善升高COVID-19 患者的 HGB、LYM、ALB 水平，降低患者的 NLR、AST、CK、CRP、LDH、PLR水平，对患者发挥保护作用。说明中西药结合在COVID-19治疗中有优势。 3.冠宁汤可减轻ALI小鼠的BALF、血清及肺组织中的IL-1β、IL-6、TNF-α、NE、MPO水平，可通过降低PAD4蛋白水平，减轻JNK磷酸化,抑制NETosis,减轻炎症反应。抗炎机制经由MAPK/JNK通路实现。
NETL