摘要
急性胰腺炎（AP）是由胆石症、酒精、高血脂及内窥镜逆行性胆管胰管造影术（ERCP）等因素刺激引发的胰腺的无菌性炎症，随着生活水平的提高，急性胰腺炎的发病率不断上升。轻症急性胰腺炎主要以胰腺充血、水肿以及炎性细胞浸润为主,是一种自限性疾病，预后较好;而重症急性胰腺炎多伴有胰腺出血、坏死、感染以及腺泡细胞凋亡等病理改变，常合并多器官功能障碍，病情进展迅速，病死率极高，目前针对AP的治疗还没有明确的临床治疗方案。胰腺腺泡细胞是一种终末分化细胞,主要功能为产生胰蛋白酶原，在AP中胰蛋白的过度激活和提前释放影响疾病的严重程度，因此腺泡细胞的功能障碍甚至坏死崩解在胰腺炎症的发展过程中起到非常重要的作用。 Hippo信号通路最早是在果蝇上发现的一种可以通过调节细胞增殖、凋亡和干细胞自我更新能力实现对器官大小调控的极为保守的通路。通路主要由上游的核心激酶（主要为LATS1/2、MST）、YAP/TEADs转录复合物以及下游靶基因三部分组成，不同的胞内、胞外和非细胞事件均参与Hippo通路的调节，通过效应器YAP/TAZ的亚细胞定位和蛋白稳定性影响细胞的行为、生长和增殖。VGLL4是Hippo通路中的重要成员，它的基本结构包含一个核输出信号，一个保守序列和羧基末端的两个TDU结构域，作为转录辅因子，VGLL4可以通过TDU结构域与YAP/TAZ竞争性结合转录因子TEAD蛋白上的位点，从而产生抑制细胞的增殖作用，促进凋亡等作用。细胞的增殖是炎症性疾病修复过程中十分重要的环节。 目的：探讨VGLL4在AP中Hippo通路的变化，VGLL4对AP严重程度的影响以及其分子机制。 方法：在本课题中，先利用C57BL/6小鼠多次腹腔注射雨蛙素构建AP小鼠模型，将其胰腺组织RNA进行测序，对得到的转录组测序结果进行信号通路的富集分析。同时提取小鼠原代腺泡细胞和在小鼠腺泡细胞系266-6上，利用CCK刺激并同各国Elisa实验检测炎症因子IL-6水平，LDH乳酸脱氢酶检测细胞死亡水平等方式，建立体外细胞AP损伤模型，观察VGLL4的变化情况。 随后考虑到HIPPO信号通路在胚胎发育过程中的作用，腺泡细胞也是急性胰腺炎的主要效应细胞之一，构建并繁育了由雌激素诱导的腺泡细胞中特异性敲除VGLL4的转基因小鼠，通过给成年小鼠中胰腺腺泡细胞诱导VGLL4缺失，观察胰腺组织表型的变化。对转基因小鼠用Cae进行AP诱导，利用H&E和血清学检测淀粉酶、脂肪酶水平判断胰腺损伤程度的差异。随后进行体外实验进行验证，分别在模式细胞HEK293T和小鼠腺泡细胞系266-6中转入shRNA用于敲低VGLL4,CCK诱导后利用CCK-8细胞增殖实验检测细胞增殖水平，Western Blot检测TRAF6、NLRP3水平。 最后，给小鼠进行VGLL4的模拟多肽super-TDU的回输，观察AP的炎症损伤是否加重。 结果：发现Hippo信号通路在AP过程变化明显，并且在体内和体外实验中均证实VGLL4表达下降十分明显，同时发现腺泡细胞中VGLL4的基础表达值并不低。在小鼠成年状态下特异性敲除腺泡细胞中的VGLL4,胰腺没有发生显著形态或者功能的改变，仅HIPPO通路相关部分基因发生相应变化。而在急性胰腺炎状态下，敲除VGLL4对AP有保护作用，胰腺的水肿、炎细胞浸润和出血死亡更轻，表明VGLL4基因增加了胰腺对于炎症的敏感性。体外细胞实验也证明仅仅敲低VGLL4对细胞的增殖影响不显著，而通过诱导细胞胰腺炎模型情况下，细胞增殖受到显著影响。在266-6细胞上敲低Vgll4并诱导细胞胰腺炎模型，发现NLRP3在敲低组表达减少，TRAF6表达也下降。继续探索VGLL4抑制细胞增殖的机制，发现在胰腺中VGLL4主要是与TEAD家族蛋白中的TEAD1/2结合发挥抑制细胞增殖的效应，通过co-IP实验证明VGLL4与TEAD1/2之间的结合作用。静脉注射根据VGLL4与TEAD结合的结构域设计的小分子模拟多肽super-TDU加重了AP的损伤。 结论：在AP中，HIPPO通路和VGLL4发生显著的变化，VGLL4表达下降。VGLL4缺失在胰腺组织应对雨蛙素诱导的损伤时降低了敏感性，起到了减轻损伤的作用。Vgll4能够抑制腺泡细胞增殖，并通过上调TRAF6促进炎症进展。VGLL4与TEAD1/2结合抑制下游靶基因CYR61、CTGF等的转录，静脉回输VGLL4模拟类似物加重AP损伤。
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