摘要
目的:研究补体C9基因缺陷（C9-/-）抑制DSS诱导的溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）进展的作用及机制，为临床靶向治疗UC提供实验依据。 方法:（1）建立实验动物模型:2-2.5月龄C9-/-小鼠和野生型（Wild type,WT）小鼠（背景均为C57BL/6小鼠）随机分为对照组、实验组，对照组小鼠正常饮水，实验组小鼠分别饮用含有3％葡聚糖硫酸钠（Dextran sulfate sodium,DSS）的水2、4、6天，建立DSS诱导的UC模型。（2）评估模型小鼠的大体指标:建模期间每天监测小鼠的体重变化、精神状态以及疾病症状变化，包括大便性状、便血情况等，计算疾病活动指数（Disease active index,DAI）。分别在实验2、4、6天后处死小鼠，测量结肠长度，称量脾重，并计算脾体指数（脾脏质量mg/体重g）。（3）小鼠结肠组织进行病理染色（HE和PAS染色），观察两组小鼠结肠组织病理变化。免疫荧光检测小鼠结肠上皮损伤及炎症细胞浸润情况。（4）流式细胞术检测:在疾病的不同进展中，检测小鼠脾脏和肠系膜淋巴结（Nodi lymphatici mesenterici,mLN）中巨噬细胞、中性粒细胞、抑制性细胞群的比例和数量变化。（5）细胞因子测定:提取结肠组织RNA,测定抑制性细胞因子IL-10、TGF-β的水平。（6）Western Blot:制备结肠组织匀浆（Colon tissue homogenate,CTH）,检测结肠组织中 NF-κB、MAPK、p-STAT5等的表达水平。 结果:（1）C9-/-小鼠模型鉴定:通过提取小鼠的基因组DNA,利用C9基因的上下游引物进行PCR扩增反应验证C9-/-小鼠基因型。同时，通过WB检测了结肠组织中C9蛋白的表达，证明C9-/-小鼠基因型无误。（2）正常饮水组，C9-/-和WT小鼠体重、粪便性状等变化没有显著性差异。DSS诱导组，与WT小鼠相比，C9-/-小鼠DSS诱导的肠炎症状明显减轻:小鼠活跃度较好，大便性状评分低;体重下降程度自第3天至第6天体重下降程度均低于WT小鼠。同时疾病活动度指数（DAI)明显低于WT小鼠。（3）第6天时C9-/-小鼠结肠长度明显长于WT小鼠，脾体指数显著低于WT小鼠。C9-/-小鼠结肠上皮较为完整，杯状细胞的数量及MUC2的丢失较少，炎症细胞浸润较少，而WT小鼠结肠上皮坏死脱落、杯状细胞减少甚至消失，MUC2表达明显减少，炎症细胞大量浸润。同时，免疫荧光检测发现C9-/-小鼠紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-1及黏附连接蛋白E-cadherin的表达均高于WT小鼠，提示C9-/-小鼠结肠上皮损伤程度明显低于WT小鼠。（4）免疫荧光检测发现，随着疾病不断进展，炎症细胞的浸润逐渐增多，但第4天和第6天时，C9-/-小鼠结肠组织中白细胞（CD45+）、中性粒细胞（MPO+）和巨噬细胞（F4/80+）的浸润及结肠上皮细胞的凋亡数量明显少于WT小鼠。（5）流式细胞术分析发现，在3％DSS诱导UC4天时，C9-/-小鼠脾脏中MDSCs的亚群G-MDSCs比例和数量显著低于WT小鼠（P＜0.05）,M-MDSCs细胞群未见显著性差异，提示G-MDSCs可能发挥更关键的作用。重要的是，在3％DSS诱导UC 4天时C9-/-小鼠脾脏中Treg细胞群的数量和比例均高于WT小鼠（P＜0.0001）,而肠系膜淋巴结中无统计学差异。到第6天时，C9-/-小鼠脾脏和肠系膜淋巴结中Treg细胞群的数量和比例均高于WT小鼠（P＜0.05）。（6）通过qPCR和IF检测发现C9-/-小鼠结肠组织中IL-10、TGF-β等抑制性细胞因子的表达显著高于WT小鼠（P＜0.05）;FACS检测发现:3％DSS诱导UC4天时，C9-/-小鼠脾脏中CD4+T细胞的比例和数量显著低于WT小鼠且有统计学意义（P＜0.01），而mLN中无明显差异;在第6天时,C9-/-小鼠脾脏和肠系膜淋巴结中CD4+T细胞的比例和数量显著低于WT小鼠且有统计学意义（P＜0.05,P＜0.01）。（7）WB和IF检测发现C9-/-小鼠结肠组织中NF-κB的表达显著低于WT小鼠，p-STAT5的表达显著高于WT小鼠。上述结果提示C9-/-小鼠体内炎症反应发生时间明显晚于WT小鼠，且结肠上皮损伤及炎症程度也明显低于WT小鼠，补体C9基因缺陷一方面可能通过抑制NF-κB信号通路下调UC小鼠体内的炎症反应，另一方面，可能通过活化STAT5信号通路来抑制UC进展。 结论:（1）C9基因缺陷减轻DSS诱导的小鼠结肠上皮损伤和肠道屏障破坏;（2）C9基因缺陷可以增加Treg细胞群的比例和抑制性细胞因子的分泌而减少促炎性细胞的浸润;（3）C9基因缺陷可能通过抑制NF-κB信号通路和激活STAT5通路增加Treg细胞群的比例和抑制性细胞因子的分泌减轻UC炎症反应。
NETL