摘要
菜心（Brassicarapavar.parachinensis）是我国南方销售量最大的特色蔬菜之一，其口感鲜嫩，营养丰富，深受消费者喜爱。菜心采收后，叶片易黄化衰老,茎部组织出现木质化及空心现象，严重影响其产品品质及经济价值。目前对菜心茎部组织木质化衰老的调控机制尚缺乏深入研究，因此，研究采后菜心薹茎木质化的分子机制具有重要的理论与应用价值。WRKY基因家族是植物特有的一大类转录因子，在植物的生长发育、开花、休眠、衰老等过程中发挥重要的转录调控作用。本研究在明确自发气调包装袋可以延缓采后菜心薹茎硬度增加、抑制木质素及纤维素含量上升等指标的基础上，通过qRT-PCR技术分析t茎中相关木质素合成酶基因表达规律，并进一步利用酵母文库构建、酵母单杂交、转基因功能验证等方法阐明WRKY转录因子对菜心薹茎采后木质化的转录调控作用。本文主要研究结果如下: 1、研究了自发气调包装对采后菜心薹茎衰老的影响。与对照相比，MP30自发气调包装袋减缓了薹茎硬度、失水率的增加、延缓了纤维素的增加和木质素的积累;可抑制MDA含量的上升，维持较高的维生素C和可溶性蛋白含量;抑制了POD酶活性、PAL酶活性的升高，同时qRT-PCR研究结果发现MP30气调包装袋包装能明显抑制薹茎木质素合成关键酶基因（BcPAL3、BcCAD3、BcPODC3、BcPOD69、BcPOD32）和纤维素酶（BcCEL3）、半纤维素酶基因（BcXET2、BcXET3、BcMAN1、BcMAN5、BcMAN6）的表达。 2、菜心薹茎中WRKY转录因子的克隆、鉴定。从薹茎中克隆分离了8个WRKY转录因子(BcWRKY70-1/70-2/70-3、BcWRKY33-1/33-2/33-3、BcWRKY13和BcWRKY48）,并对这些转录因子进行了生物信息学分析。氨基酸序列对比分析发现，BcWRKY70-1/70-2/70-3、BcWRKY33-1/33-2/33-3、BcWRKY13和BcWRKY48均含有一个WRKY结构域。系统发育树分析表明，BcWRKY70-1/70-2/70-3属于WRKY家族Ⅲ类，与拟南芥AtWRKY70亲缘关系比较近;BcWRKY33-1/33-2/33-3属于WRKY家族Ⅰ类，与拟南芥AtWRKY33亲缘关系比较近;BcWRKY13和BcWRKY48属于WRKY家族Ⅱ类c亚族，分别与拟南芥AtWRKY13和AtWRKY48亲缘关系比较近。在烟草瞬时表达WRKY的亚细胞定位结果显示，BcWRKY70-1、BcWRKY33-1、BcWRKY13和BcWRKY48均为核蛋白，定位于细胞核中。 3、WRKY转录因子对木质素合成途径的调控。转录激活活性分析表明，BcWRKY70-1/70-3、BcWRKY33-1/33-2/33-3在酵母体内具有转录激活活性，BcWRKY70-2的转录激活现象不明显，而BcWRKY13和BcWRKY48在酵母体内则无转录激活能力。酵母单杂交结果显示，BcWRKY70-1/70-2能够与BcPAL3、BcCAD3、BcPODC3、BcPOD69和BcPOD32基因启动子中的W-box结合，BcWRKY70-3能与BcCAD3和BcPOD69启动子中的W-box结合,BcWRKY33-2能与BcCAD3启动子中的W-box结合，从而调控这些基因启动子的表达。双荧光素酶实验结果表明，BcWRKY70-1作为激活子，能够与BcPAL3、BcCAD3、BcPODC3、BcPOD69和BcPOD32基因启动子结合并激活它们的表达。酵母双杂交实验结果表明，BcMPK7与BcWRKY13、BcMPK3与BcWRKY13、BcWRKY70-1与BcWRKY48在酵母体内存在相互作用，表明BcWRKYs既能相互之间形成同源二聚体，又能与上游激酶相互作用，共同调控基因表达。 4、拟南芥过表达分析WRKY转录因子功能。通过花序侵染法，在拟南芥过表达菜心BcWRKY70-1转录因子。实验发现，与野生型相比，转基因拟南芥的生长缓慢，序茎变矮。同时，转基因植株茎和叶中的BcWRKY70-1表达量显著高于野生型，且纤维素合成酶基因(AtCesA1、AtCesA7、AtCesA8)和多个木质素合成关键酶基因(AtPAL1、AtHCT、AtCCR1、AtC3H、At4CL1、AtC4H、AtCAD6、AtCCoAoMT1、AtCOMT、AtF5H)的表达水平高于野生型。 综上所述，自发气调包装可显著抑制菜心茎组织木质素、纤维素、半纤维素等含量的上升，延缓薹茎硬度增加;抑制木质素合成基因、BcWRKYs基因的上调表达。进一步研究结果表明BcWRKYs能够通过结合木质素合成相关基因启动子并激活其表达，参与木质素合成途径的调控;同时研究结果表明BcWRKYs能与MPK蛋白互作，可能形成调控网络影响木质素的合成积累，拟南芥过表达BcWRKY70-1影响薹茎的生长发育，证实BcWRKY70-1参与了菜心薹茎的衰老。
NETL