摘要
银杏是古老的孑遗植物，又是珍贵的经济树种和绿化树种，其树形端正，秋色叶金黄，具有极高的观赏价值，被广泛应用于城市园林绿化中。银杏树的寿命长，我国存有大量的古树，在多地形成富有特色的古银杏群落公园。银杏雌雄异株，是典型的风媒传粉树种。近年来，城市绿化大量种植银杏雄株，空气中银杏花粉量急剧增加导致雌株的结实量大幅提升。过度结实不仅影响景观，污染环境，还由于过度消耗树体营养，造成树势衰弱，直至死亡。 银杏的种实发育(主要指胚乳)并非受精作用的产物，但授粉对种实发育的影响尚不明确。本论文以授粉与未授粉的胚珠为实验材料，通过外源试剂喷施处理，探究出有效控制结实量的措施，并通过转录组数据分析集合结构观察，揭示授粉在银杏种实发育中的功能。主要结果如下： (1)传粉期前剪取带有胚珠的银杏枝条进行实验室水培，在珠孔处出现传粉滴时进行授粉与未授粉处理。观察发现，前7天授粉与未授粉胚珠并无明显差异；7-14天，授粉胚珠呈现缓慢生长的趋势，而未授粉胚珠基本不发育；14-28天，授粉胚珠呈现出快速发育的模式，而未授粉的胚珠则表现出衰败的趋势。同样结果在树体上套袋与未套袋处理的胚珠中也得到了验证，说明授粉对银杏胚珠和种实发育至关重要。 (2)银杏授粉过程主要包括传粉期珠孔处产生传粉滴、花粉通过传粉滴的收缩作用经珠孔道进入贮粉室。对授粉与未授粉胚珠进行结构观察，扫描电镜实验发现，授粉胚珠发育正常，授粉后珠孔呈现出紧缩状态，贮粉室开口随即闭合；而未授粉胚珠的珠孔仍呈现出向外翻卷的漏斗状，贮粉室开口不闭合。石蜡切片结果也同样显示，授粉胚珠珠孔道随着珠被发育逐渐闭合，珠心组织内部功能大孢子分裂形成游离核，并随着发育时间的增加，游离核数量剧烈增殖，体积增大；未授粉胚珠的珠被发育停止，珠孔道无法闭合，珠心组织内部仍可产生游离核，但游离核的数量少，后期游离核停止分裂增殖，胚珠败育。上述研究表明，未授粉胚珠的珠孔道和贮粉室开口无法闭合，功能大孢子和游离核虽仍可正常分化形成，但游离核增殖缓慢甚至停止，胚珠败育主要发生在游离核增殖时期。 (3)为了筛选阻碍授粉减少结实的有效方法，对银杏胚珠进行外源喷施处理。发现喷施0.4°Be石硫合剂后，传粉滴仍可正常分泌，喷施稀释500倍液的抗蒸腾剂(主要成分为黄腐酸、脱落酸和腐植酸)和0.1g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)均可有效控制传粉滴的分泌。喷施处理7天后，三组处理的胚珠开始呈现萎蔫状态，至14天萎缩状态明显，但三种处理的败育率差异显著，稀释500倍液抗蒸腾剂效果最佳，败育率为95%,0.4°Be石硫合剂效果次之，败育率为88%,0.1g/LPVP败育率为73%,且三种试剂对叶片的生长发育均无不良影响。 (4)对未授粉和授粉处理14天、28天的胚珠进行转录组测序，共筛选出35788个差异基因。差异基因GO分析主要富集在防御反应、生物刺激反应、无机分子跨膜转运活性，KEGG分析主要富集在苯丙素的生物合成、光合作用、植物激素信号转导以及淀粉和蔗糖代谢生物过程中。其中在生长素、细胞分裂素、赤霉素和油菜素内酯信号转导通路中分别鉴定到16、6、2和4个差异基因，在未授粉胚珠中整体呈下调表达。而脱落酸、水杨酸、茉莉酸和乙烯信号转导通路中分别鉴定到8、4、4和6个差异基因，尤其茉莉酸信号通路的大部分基因在未授粉胚珠中大幅度上调表达，暗示授粉通过影响胚珠内激素的合成和分布影响种实发育。 (5)在授粉与未授粉胚珠转录组数据中共筛选到25个表达量差异的GbMADS基因。转录组及qRT-PCR结果均显示GbMADS28和GbMADS33在未授粉胚珠中表达量显著下降。进一步通过序列比对分析GbMADS28和GbMADS33与被子植物中参与雌蕊发育的GGM13和AG同源性较高，推测其可能在银杏胚珠的发育中可能起到重要的作用，其功能和作用机制仍需进一步深入研究。
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