摘要
产肠毒素大肠杆菌F18(EscherichiacoliF18,E.coliF18)引起的断奶仔猪细菌性腹泻是当前集约化、规模化养猪生产中较为常见的一类传染性肠道炎症疾病，细菌性腹泻相对于病毒性腹泻而言，虽然死亡率不高，但是严重影响猪的增重，降低饲料的报酬率，导致生产效益低下。然而，目前关于地方猪品种对大肠杆菌F18抗性的遗传基础和调控机制有待进一步阐明。课题组前期基于梅山断奶仔猪F18抗性型和易感型十二指肠组织转录组测序分析,筛选出1个重要差异表达基因—核心岩藻糖基转移酶8(FUT8),FUT8作为目前发现的唯一一个核心岩藻糖基转移酶，广泛参与肿瘤发生、免疫反应、肠道菌群调节、细胞黏附等多种生命过程，但其对猪大肠杆菌F18易感性的作用及调控机制尚不清楚。本研究以梅山猪不同组织和猪小肠上皮细胞系(IPEC-J2)为研究对象，首先从组织和细胞水平、mRNA和蛋白质水平上系统验证猪FUT8基因表达水平与大肠杆菌抗性的关系，其次通过比较转录组测序筛选FUT8基因下游调控的关键基因及信号通路，并在细胞水平上验证FUT8介导信号通路对大肠杆菌F18易感性的调控作用，最后利用截短处理和双荧光素酶活性试验鉴定FUT8上游核心启动子区域，并探究其突变位点对启动子转录活性的影响以及功能突变位点在不同猪品种群体多态性分布情况。具体结果如下: 1.为了探究猪FUT8基因表达与E.coliF18感染的关系，首先在组织水平上发现FUT8基因在梅山猪35日龄仔猪不同组织中均有一定水平的表达，并且在E.coliF18易感型个体的肠道组织(十二指肠和空肠组织)中表达水平显著高于抗性型(P＜0.05)。其次，利用荧光定量PCR和蛋白免疫印迹(Westernblot)检测了F18ab、F18ac菌体刺激和LPS诱导IPEC-J2细胞前后FUT8mRNA和蛋白表达情况，结果显示，F18ac感染显著提高了FUT8基因转录和蛋白表达水平(P＜0.05);LPS诱导细胞6h后，FUT8基因的表达极显著上升(P＜0.01)。此外，本研究成功构建了FUT8基因慢病毒干扰的猪小肠上皮细胞系，结合大肠杆菌体外黏附实验发现FUT8基因下调表达显著降低了E.coliF18菌株与IPEC-J2的黏附水平。由此表明，FUT8基因在梅山断奶仔猪抵抗E.coliF18侵染的过程中确实发挥了重要的调控作用，并且其表达水平下调有利于提高机体对大肠杆菌F18感染的抵抗能力。 2.为了进一步探究FUT8基因对猪大肠杆菌F18抗性的分子调控机制，本研究利用RNA-seq技术对FUT8干扰前后的IPEC-J2细胞进行了比较转录组测序分析。结果显示，两组间筛选出177个差异表达基因(DEGs),KEGG通路注释显示大部分DEGs主要富集在Toll样受体信号(Toll-likereceptorsignaling)和鞘糖脂生物合成(Glycosphingolipidbiosynthesis)等通路中。在此基础上，表达验证发现FUT8干扰组鞘糖脂生物合成通路基因整体呈现下降趋势,其中FUT2、B3GALNT1、ST3GAL4、FUT9、B4GALT1表达水平显著下调，Toll样受体信号通路中部分基因(TLR3、TLR5、TLR8、MAP3K7、NF-κB)也表现出显著的下调表达。此外，为了探究FUT8基因对紧密连接蛋白的影响，利用qRT-PCR和Westernblot检测了ZO-1、Occludin、Claudin基因在FUT8干扰细胞中的表达变化，FUT8基因干扰后，紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin基因无显著变化(P＞0.05)。由此表明，猪FUT8基因可能通过介导Toll样受体免疫信号通路和鞘糖脂生物合成通路在猪抵抗大肠杆菌F18感染过程中发挥关键作用。 3.为了探究FUT8上游启动子区的转录调控机制，本研究通过生物信息学分析和双荧光素酶试验来鉴定猪FUT8基因核心启动子区域，并利用PCR克隆测序筛选其潜在的突变位点。结果显示，猪FUT8基因的核心启动子位于-1213bp?-673bp,并且在-774bp区域存在1bpC碱基插入突变。针对该位点，分别构建了猪FUT8基因的野生型(PGL3-FUT8-wt)和突变型载体(PGL3-FUT8-mut),重组质粒转染293T细胞进行荧光素酶活性分析，结果显示猪FUT8基因-774bp区域碱基C插入突变显著降低了其启动子区转录活性(P＜0.01)。生物信息学软件预测发现，FUT8核心启动子区存在MY8、BCL6、STAT1、REST、C/EBPα和CREBBP等潜在转录因子结合位点，其中该碱基插入突变位于C/EBPα转录因子，进一步利用双荧光素酶活性验证发现-774bp碱基C插入突变显著抑制了C/EBPα与FUT8启动子的转录结合活性，由此表明FUT8基因核心启动子区-774bp/C碱基插入突变可能对其转录表达具有调控作用。此外，利用PCR扩增测序对梅山猪、大白猪和淮猪不同品种群体中-774bp/C碱基插入突变进行多态性分布检测，结果显示，不同品种猪FUT8基因核心启动子区-774bp处均存在C碱基插入突变，其中地方猪品种(梅山猪和淮猪)突变频率较高，分别为0.77和0.65;而外来品种大白猪群体中突变个体较少，频率为0.10。 因此,本研究系统揭示了FUT8基因对断奶仔猪E.coliF18抗性的调控作用及其分子机制，并鉴定出1个重要突变位点(-774bp碱基C插入突变)，该研究有望确定梅山断奶仔猪E.coliF18腹泻病抗性的重要功能基因和有效遗传标记，为今后制订抗仔猪细菌性腹泻病分子选育策略提供依据。
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