摘要
在哺乳动物中，5-甲基胞嘧啶(5mC)形式的DNA甲基化可以通过TET蛋白介导，将5mC氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5-甲酰基胞嘧啶(5fC)和5-羧甲基胞嘧啶(5caC),该过程被称为DNA主动去甲基化。DNA主动去甲基化产物及其相关蛋白TET蛋白是调节基因表达的重要表观遗传修饰物。现已发现DNA主动去甲基化产物及TET1蛋白广泛存在于各种细胞中，影响多种生物过程。5hmC、5fC、5caC在细胞体内的含量依次降低，且其结构类似，难以被准确测定，其生物学功能尚未得到深入探索。TET1蛋白作为DNA去甲基化酶，在动植物生理生化过程中起着关键作用，可作为新的生物诊断物。 本工作以金属硫化物为光活性材料，结合二维纳米材料MXene优异的导电性和电子迁移速率及其合适的能带带隙，两者可以通过形成能带匹配结构或构建肖特基结等方式提高金属硫化物的光电性能。为提高生物传感器的灵敏性，基底采用层层滴加的MXene-NH2/CdS、MXene/Bi2S3,形成肖特基结的SnS2@MXene及Bi2O3/Bi2S3/MXene三元材料，利用DNA主动去甲基化产物(5hmC、5fC、5caC)上官能团的共价反应，实现对DNA主动去甲基化产物的识别，将其分别与纳米酶、钌基络合物、G-四联体线信号扩增策略相结合，构建光电化学生物传感器，实现对DNA主动去甲基化产物及其相关蛋白的特异性检测。为研究农作物中DNA主动去甲基化产物作为污染物生态毒理效应的新标志物的可行性，探究了抗生素、重金属、全氟化合物及塑化剂等污染物对农作物组织基因组DNA中DNA主动去甲基化产物含量的影响。这项工作为评估环境污染物的生态毒理学效应提供了几种可能的生物标志物和替代的评价技术，并可以应用于TET蛋白抑制剂的筛选。 本论文研究内容分为以下四部分: (1)5hmC的含量仅次于5mC,被称为DNA的“第六碱基”，约占胞嘧啶含量的15％左右。以5hmdCTP为检测靶标，CdS/MXene为光敏材料，ZnSnO3纳米球为信号放大单元，构建了一种新型的基于抗原抗体免疫识别的DNA羟甲基化检测PEC生物传感器。在最佳条件下，该传感器的线性范围为8pM～100nM,最低检测限为4.21pM(3σ)。通过研究Cd2+和PFHS污染物对小麦幼苗根和叶基因组DNA中5hmdCTP含量的影响，评价了所开发方法的适用性。 (2)5fC现在被认为是DNA的“第七碱基”，约占胞嘧啶含量的0.02％～0.002％。作为TET双加氧酶催化的5mC的顺序氧化产物之一，5fC约占5hmC含量的1％。为实现对5fC的灵敏检测，以Bi2S3:MXene为光活性材料，聚多巴胺为固体电子给体和5fdCTP捕获试剂，以煅烧ZIF-8(C-ZIF-8)为人工酶结合PEC传感器检测5fdCTP。在C-ZIF-8的催化下，4-氯-1-萘酚(4-CN)被H2O2氧化生成不溶性的苯并-4-氯己二烯酮(4-CD),并沉积在电极表面，导致PEC响应降低。在最优条件下，传感器的线性范围为1pM～200nM,检出限为0.51pM(3σ)。通过研究抗生素对玉米幼苗根系基因组DNA中5fdCTP含量的影响，验证了该方法的适用性。与空白对照组相比，灰黄霉素及林可霉素会抑制玉米根系中5fdCTP含量。克拉霉素及环丙沙星会提高玉米根系中5fdCTP的含量，为污染物对作物的影响提供了新的信息。 (3)5caC作为DNA主动去甲基化产物之一，其丰度极低，约占胞嘧啶含量的0.00018％。作为5fC的顺位氧化物，5caC结构类似于5mC、5hmC、5fC,这使其准确检测困难。因此，迫切需要开发一种高灵敏度、高选择性的痕量生物传感器来检测5caC。以SnS2@Ti3C2复合材料为光敏材料，聚乙烯亚胺为5cadCTP的捕获试剂，Ru(NH3)63+为信号放大光敏剂实现了对5caC的灵敏检测。利用了PEI中的-NH2与5cadCTP的-COOH在EDC/NHS活化下的共价反应，实现了高的检测选择性。在最优条件下，传感器的线性范围为1pM～0.2μM,检出限为0.26pM(3σ)。该方法具有很高的检测特异性，可以区分5caC及其衍生物。此外，通过检测经重金属Cd2+、PFHS、抗生素及塑化剂培养后水稻幼苗基因组DNA中5caC含量的变化来评价其适用性。 (4)TET1蛋白可以将5mC转化为5hmC,在M.HhaI甲基转移酶的催化下，5hmC的-CH2OH会进一步与-SH发生共价反应。基于此，一种全新的TET1蛋白光电电化学检测技术应运而生。以MXene/Bi2O3/Bi2S3三元复合材料为光敏材料，结合DNAWalker与Nb.BbvCI酶辅助信号放大策略，输出指数级富鸟嘌呤片段。在Mg2+的辅助下，富鸟嘌呤片段自组装成G-wire上层结构，为MB提供了更多的加载位点，并放大了PEC信号。在最佳实验条件下，TET1蛋白的线性范围为0.1～10μg/mL,检出限为0.024μg/mL(3σ)。通过抑制剂筛选实验对TET1蛋白活性的影响来评价所提方法的适用性。
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