摘要
石榴为石榴科石榴属植物，石榴皮为石榴的干燥果皮，是中国常用的中草药之一，早在《本草纲目》中就有记载，石榴皮酸、温、涩、无毒，对痢疾、胃痛腹泻和恶性肿瘤有治疗作用。石榴皮中含有丰富的三萜类化合物，为能有效提高石榴皮的利用度，需对石榴皮中的三萜进行提取纯化及对其生物活性进行深入研究。本文以石榴皮为原料，采用超声辅助乙醇提取法对石榴皮中的三萜进行提取，利用D-101大孔吸附树脂对其进行纯化，并通过LC-MS/MS分析鉴定了石榴皮三萜提取物的结构。随后对石榴皮中的三萜、对应癌症靶点以及通路进行网络药理学分析，筛选出与癌症相关的靶点及通路。并在此基础上，选用H460细胞癌症模型研究石榴皮三萜提取物的体外抗肿瘤活性及作用机制。最后以石榴皮三萜为原料研发一款石榴皮三萜产品。结果如下: (1)采用单因素和响应面试验确定了超声辅助乙醇提取的最优工艺条件:乙醇浓度为88％,料液比为1∶30,超声温度为56℃,超声功率为243W。该条件下的乙醇提取液中三萜含量为293.62μg/mg。 (2)用筛选出的D-101大孔树脂对石榴皮三萜提取液进行纯化，分别用0、15、30、50、75、90％浓度的乙醇对D-101大孔树脂柱进行梯度洗脱。其中30％乙醇洗脱液中的三萜含量为752.83μg/mg,纯度最高，为75.28％,故使用30％乙醇洗脱组分用于接下来的实验。 (3)通过LC-MS/MS对30％乙醇洗脱组分进行分析，确定了其中主要的12种三萜成分，含量最高的为积雪草酸、科罗索酸、山楂酸。通过网络药理学以及生物信息数据库等方法对化合物、癌症靶点以及通路进行筛选，预测石榴皮三萜提取物与癌症有密切联系的靶点为AKT1、EGFR、SRC、CASP3、GRB2等，主要作用于MAPKsignalingpathway通路。 (4)分别检测石榴皮三萜对HepG2、MCF-7、H460、A549、Caco-2、PC-3和HK-2细胞的细胞毒性，发现石榴皮三萜对H460人大细胞肺癌细胞有明显的选择性，故将H460作为研究对象进行进一步研究。在此基础上，使用了CCK-8、集落实验、流式细胞仪、Hoechst染色、ROS检测、线粒体膜电位检测、WB等方法进行体外抗癌活性以及机制的研究。结果显示石榴皮三萜能够抑制细胞增殖、促进凋亡、降低线粒体膜电位、提高ROS水平。WB检测了凋亡相关蛋白的表达，结果显示，随着药物浓度的升高，Bax、Bcl-2、CytochromeC、Cleavedcaspase-3以及Cleavedcaspase-9等表达量上升。为了探究促进凋亡的机制，用WB对网络药理学预测的靶点其进行检测，结果显示SRC、GRB2、EGFR蛋白表达量发生了明显的变化，推测石榴皮三萜主要是通过MAPKsignalingpathway通路中的SRC、GRB2、EGFR蛋白诱导细胞凋亡。 (5)石榴皮三萜口服液的最优配方为:石榴皮三萜添加量0.6％,石榴汁添加量8％,果葡糖浆添加量4％,柠檬酸添加量0.06％。最佳复合稳定剂配比:CMC-Na添加量0.06％,三聚磷酸钠添加量0.1％，瓜尔豆胶添加量0.02％。
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