摘要
奶牛围产期多种应激原的存在导致体内皮质醇水平急剧升高，增加了产后子宫感染和子宫复旧延迟的风险。奶牛子宫内膜主要由奶牛子宫内膜上皮细胞和奶牛子宫内膜基质细胞(BESCs)组成，两种细胞相互作用共同促进子宫内膜组织的修复。产后子宫内膜上皮受损，导致BESCs易遭受病原微生物感染，因此明确皮质醇对BESCs先天免疫和增殖的影响机制具有重要意义。本试验使用LPS诱导原代BESCs炎性模型，采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术、免疫印迹技术、免疫荧光技术和流式细胞术等方法探究不同浓度皮质醇调控BESCs先天免疫反应和增殖的分子机制;通过体内试验建立高皮质醇水平下大肠杆菌感染的山羊子宫内膜炎模型，通过临床指标观察、组织病理学检查、免疫组织化学法和qRT-PCR等方法探究高水平皮质醇对炎性子宫内膜增殖和修复的影响机制，为深入了解奶牛子宫内膜炎的发病机制提供理论依据。 1.皮质醇对LPS诱导的BESCs先天免疫/炎性反应的影响 本试验通过Ⅱ型胶原酶消化法获得活力好、纯度高的BESCs,成功建立原代BESCs分离培养方法。采用RT-qPCR技术、Westernblot技术和免疫荧光技术等方法检测不同浓度皮质醇(5、15和30ng/mL)对LPS诱导的BESCs炎性反应的影响。结果显示，LPS诱导BESCs中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA相对表达量极显著升高(p＜0.01),5、15和30ng/mL皮质醇显著或极显著抑制LPS诱导的BESCs中炎性因子mRNA的相对表达量(p＜0.05,p＜0.01)。LPS处理后，细胞中COX-2和iNOSmRNA和蛋白的表达量极显著升高(p＜0.01),不同浓度皮质醇极显著抑制LPS诱导的BESCs中COX-2和iNOS的表达量(p＜0.01)。LPS处理后，BESCs中IκBα、p65、ERK、JNK和p38的磷酸化水平显著或极显著升高(p＜0.05,p＜0.01),不同浓度皮质醇均显著抑制LPS诱导的NF-κB和MAPK信号通路关键蛋白的磷酸化水平(p＜0.05,p＜0.01)以及p65蛋白的核移位(p＜0.05)。以上结果表明，皮质醇通过抑制NF-κB和MAPK信号通路抑制LPS诱导的BESCs炎性反应。 2-皮质醇对LPS处理的BESCs增殖的影响 使用LPS诱导BESCs炎性模型，采用CCK-8法、流式细胞术、RT-qPCR技术和Westernblot技术等方法探究皮质醇对BESCs增殖的影响。结果显示，LPS处理BESCs促进了PCNA蛋白的表达(p＜0.05),G0/G1期的细胞数目极显著减少(p＜0.01),S期的细胞数目极显著增多(p＜0.01)。LPS促进BESCs细胞划痕的愈合率和细胞增殖(p＜0.01)。相比LPS单独处理，不同浓度皮质醇和LPS共处理后，PCNA蛋白的表达显著或极显著下降(p＜0.05,p＜0.01),S期细胞数目显著或极显著减少(p＜0.05,p＜0.01),细胞划痕的愈合率降低(p＜0.01)。与对照组相比，LPS组细胞中PI3K、AKT和GSK3β蛋白的磷酸化水平及β-Catenin、c-Myc和CyclinD1蛋白的表达量极显著升高(p＜0.05,p＜0.01)。与LPS组相比，不同浓度皮质醇和LPS共处理组细胞中PI3K、AKT和GSK3β的磷酸化水平及β-Catenin、c-Myc和CyclinD1蛋白的表达量显著或极显著下降(p＜0.05,p＜0.01),同时极显著降低细胞核内β-Catenin水平(p＜0.01)。不同浓度皮质醇抑制LPS处理后细胞中TGF-β1、TGF-β3、VEGF、FGF-2和MMP-9的mRNA相对表达量(p＜0.01)。以上结果表明在LPS处理的BESCs细胞中，皮质醇能抑制PI3K/AKT/GSK3β和Wnt/β-Catenin信号通路活化以及降低生长因子的表达，从而抑制细胞增殖。 3.阻断GR逆转皮质醇对BESCs增殖的影响 使用AL082D06(D06)阻断细胞的GR,探究GR在皮质醇抑制LPS处理的BESCs增殖中的作用。结果显示，与LPS+皮质醇组相比，LPS+皮质醇+D06组细胞中PCNA蛋白的表达量显著升高(p＜0.05),S期细胞数显著升高(p＜0.05),细胞划痕愈合率显著提高(p＜0.05),阻断GR逆转了皮质醇对细胞迁移、细胞周期和增殖的抑制作用。与LPS+皮质醇组相比，D06+LPS+皮质醇组细胞中PI3K、AKT和GSK3β的磷酸化水平及β-Catenin、c-Myc和CyclinD1蛋白的表达量显著或极显著升高(p＜0.05,p＜0.01),细胞核内β-Catenin荧光极显著增强(p＜0.01)。与LPS+皮质醇组相比，阻断GR后细胞中TGF-β1、TGF-β3、FGF-2、VEGR和MMP-9mRNA的相对表达量显著或极显著升高(p＜0.05,p＜0.01)。以上结果表明，阻断GR可逆转皮质醇对BESCs细胞增殖的抑制作用。 4.皮质醇对细菌感染的山羊子宫内膜组织病理学及增殖相关因子的影响 以奶山羊作为实验动物，通过肌内注射皮质醇模拟应激(高皮质醇水平)状态，使用3％冰醋酸损伤子宫后灌注E.coli建立子宫内膜感染模型，观测在高皮质醇水平下E.coli感染的山羊子宫内膜增殖修复的变化。试验分为对照组、冰醋酸组、冰醋酸+E.coli组、冰醋酸+E.coli+皮质醇组和冰醋酸+皮质醇组。结果显示，与冰醋酸组比，E.coli感染12h后山羊的呼吸频率、心率和体温显著升高(p＜0.05)。E.coli感染后子宫分泌物中可见大量多形核中性粒细胞，子宫内膜上皮层出现明显的损伤脱落，固有层中大量炎性细胞浸润，部分子宫腺体被破坏，而在高皮质醇组山羊中上述病理变化明显减轻。与冰醋酸组相比，冰醋酸+E.coli组山羊子宫内膜厚度、腺体数和PCNA阳性细胞数极显著增加(p＜0.01),TGF-β1、VEGF、FGF-2和PCNAmRNA的相对表达量显著或极显著升高(p＜0.05,p＜0.01);与冰醋酸+E.coli组相比，冰醋酸+E.coli+皮质醇组山羊子宫内膜中上述指标被显著或极显著抑制(p＜0.05,p＜0.01)。以上结果表明，皮质醇可抑制大肠杆菌感染后子宫先天免疫反应和子宫内膜的增殖与修复。 综上所述，皮质醇抑制BESCs先天免疫反应/炎性反应和细胞增殖，皮质醇是通过GR产生这种抑制作用。高水平皮质醇可抑制大肠杆菌感染的炎性子宫内膜的增殖与修复。
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