摘要
糖尿病伤口由于高血糖水平，同时伴有长期性炎症、血管功能化受损、持续氧化应激反应和局部应力致使创面不易愈合之外，微生物侵染也会加速创面微环境恶化，进一步破坏机体组织，引发多种并发症，进而导致病死率增加，目前对慢性糖尿病伤口的治疗仍然没有让人满意的疗效。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）作为一种天然化合物，在抗炎、抗菌、抗氧化方面具有显著的疗效，然而其生物利用度差且代谢较快的缺点限制了使用。本课题利用人工多肽弹性蛋白样重组体（ELR-IK24）在液相中发生相分离的现象，结合EGCG制备成可用于治疗伤口的多酚-无序蛋白共组装水凝胶，成为能够促进愈合、方便更换的理想伤口敷料。 本课题研究分为五个部分： 第一部分通过专业软件对EGCG、HDI和ELR-IK24进行结构优化并完成分子对接。结果显示：EGCG与ELR-IK24结合能量预测最强值为-8.434kcal/mol，相互形成3组氢键和4组共轭键，显示EGCG分子能稳定的结合于蛋白活性口袋中；HDI未与EGCG结合，可与ELR-IK24结合能量预测最强值达到-4.1kcal/mol，在多肽口袋周围的氨基酸残基间产生6组范德华力、1组碳氢键和2组氢键，三者之间可以形成稳定的结合产物。 第二部分为多酚-无序蛋白共组装水凝胶的制备和浓度配比探索。采用相分离技术以ELR-IK24为密相与HDI交联制备富含EGCG的水凝胶，通过凝聚层形成时间、形成产量、流变力学、动态粘度和Zeta电位值对不同质量配比进行了探索。结果显示：EGCG和ELR-IK24之间在凝聚层形成时间和产量上相互浓度之间存在不典型的线性关系，EGCG和ELR-IK24浓度越高，其凝聚层形成时间越短，形成产量越多。HDI在水凝胶中当EGCG浓度超过1.5%时可以增加该体系的流变力学、动态粘度和Zeta电位绝对值，提升胶体稳定性，但超过0.2%的ELR-IK24相应胶体流变力学和动态粘度变化不大，因此，后续我们对1.5%EGCG和0.05-0.15%的ELR-IK24进行了探索。 第三部分通过扫描电子显微镜、体外细菌、细胞培养等技术对水凝胶进行结构和性能的表征。结果显示：水凝胶内部是无序交联的多孔结构。水凝胶通过破坏细菌胞膜来抑制细菌的生长，其水凝胶临界抑菌浓度为1.5%EGCG和0.1%ELR-IK24。DPPH法和ROS法均显示水凝胶具有典型的抗氧化活性，且随着体系中ELR-IK24含量增加抗氧化活性得到明显提升。RT-PCR法测量细胞中相关基因表达情况显示促炎因子IL-1β和iNOS显著下调，抗炎因子CD163和CD206明显上升，细胞免疫荧光染色证实水凝胶可改变M1/M2型巨噬细胞的比例，具有明显的抗炎作用。 第四部分从细胞增殖活性、细胞迁移能力、血液相容性、皮肤刺激性和全身急性毒性方面对水凝胶进行生物相容性评价。结果显示：体外L929细胞存活率均超过（93.5±2.3%），各实验组毒性评分均为0，随着ELR-IK24含量的增加，相应水凝胶表现出更强的促进细胞增殖能力和细胞粘连和爬行作用。水凝胶不具有明显的溶血性能（P＞0.05），其凝血活性没有明显差异（P＜0.05）。皮肤刺激反应时平均原发性刺激指数为0，属于无刺激反应类型，全身急性毒性实验表明各实验动物不具有任何病理损害。 第五部分构建糖尿病小鼠创面愈合模型，通过伤口愈合痕迹对比，血常规和生化检测，采用组织病理学和分子生物学技术，对伤口组织进行HE、Masson染色和相关Ki67、CD31、DHE的免疫荧光染色以及针对TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10的Elisa实验。结果显示：水凝胶可以显著促进伤口愈合（P＜0.05），调控伤口周围组织细胞增殖和血管生长，同时降低相关活性氧的表达，进而促使毛囊和胶原形成，最终表现出明显伤口愈合能力。 综上所述，本课题运用相分离技术制备了多酚-无序蛋白共组装水凝胶，生物安全性高，能促进伤口周围组织细胞增殖和血管生长，同时降低相关活性氧的表达，进而促使毛囊和胶原形成，最终表现出良好的促伤口愈合能力，可以作为一种治疗糖尿病伤口愈合的水凝胶敷料。
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